FRET法を用いたGPCR活性化の可視化

使用 FRET 方法可视化 GPCR 激活

• 批准号: 20790209
• 负责人: 小野原 直哉
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20790209/
• 关键词: GPCR; FRET法

本研究では、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の活性化をFRET法により可視化し、GPCRの局在変化や時空間的活性化機構を解明することを目的として、研究を遂行した。ロイコトリエンB4受容体(BLT1)のC末端に、CFP、YFPと呼ばれる蛍光タンパク質を、それぞれフレキシブルリンカーと共に融合させたFRETプローブを構築した。これらのプローブをHEK293細胞に発現させ、BLT1同士の二分子間FRETを検討したが、リガンド刺激による有意な変化は測定できなかった。また、受容体の細胞内第三ループ内に蛍光タンパク質を融合させたプローブや、BLT1と三量体Gタンパク質との二分子間FRETプローブを用いて同様の検討を行ったが、BLT1の活性化は測定できなかった。一方、HEK293細胞に発現させたBLT1-YFPの蛍光を数十μm^2の範囲で退色させ、退色した部分の蛍光を経時的に測定したところ、約1分程度でほぼ完全に蛍光が回復するという現象を見出した。さらに、405nmで励起すると蛍光強度が100倍増強する、PA-GFP(Photoactivatable-Green Fluorescent Protein)をBLT1のC末端に融合させたプローブを用いたところ、惹起されたBLT1-PA-GFPの蛍光が、形質膜上で拡散していくことが明らかになった。以上の結果は、BLT1が、定常状態で細胞膜上をダイナミックに移動している可能性を示唆する。これまでに、GPCRが定常状態において、形質膜上を数十μm^2単位で移動しているという報告はない。今後、BLT1の移動を制御する分子の同定や、他のGPCRについての検討が必要ではあるが、今回の結果が、GPCRの局在性に関する重要な知見となる可能性がある。

This study で は, G タ ン パ ク type total service quality by the capacity of body (GPCR) の activeness を FRET method に よ り visualization し, GPCR の bureau in space when や activeness institutions - を interpret す る こ と を purpose と し て, research を carries out し た. ロ イ コ ト リ エ ン B4 the capacity of body (BLT1) の C terminal に, CFP, YFP と shout ば れ る 蛍 light タ ン パ ク を, そ れ ぞ れ フ レ キ シ ブ ル リ ン カ ー と に total fusion さ せ た FRET プ ロ ー ブ を build し た. こ れ ら の プ ロ ー ブ を HEK293 cells に 発 now さ せ, BLT1 with James の FRET between two molecules を beg し 検 た が, リ ガ ン ド stimulus に よ る intentionally な variations change は determination で き な か っ た. ま た の cells, the body's third ル ー プ within に 蛍 light タ ン パ ク qualitative を fusion さ せ た プ ロ ー ブ や, BLT1 と three quantity body G タ ン パ ク qualitative と の FRET between two molecules プ ロ ー ブ を with い て with others の 検 line for を っ た が, BLT1 の activeness は determination で き な か っ た. Side, HEK293 cells に 発 now さ せ た BLT1 - YFP の 蛍 light を dozens of mu m ^ 2 の van 囲 で fade さ せ, fade し た part の 蛍 light を 経 に determination of し た と こ ろ, about 1 minute で ほ ぼ completely に 蛍 light が reply す る と い を う phenomenon shows し た. Youdaoplaceholder0, 405nmで excitation すると蛍 light intensity が100 times enhanced する, PA-GFP(Photoactivatable Green Fluorescent Fusion Protein) を BLT1 の C terminal に さ せ た プ ロ ー ブ を with い た と こ ろ, provoked さ れ た BLT1 - PA - GFP の 蛍 が light, form on the plasma membrane で company, scattered し て い く こ と が Ming ら か に な っ た. の above results は, BLT1 が, steady state で membrane を ダ イ ナ ミ ッ ク に mobile し て い を る possibility in stopping す る. こ れ ま で に, GPCR が steady state に お い て, form on the plasma membrane を dozens of mu m ^ 2 単 で mobile し て い る と い う report は な い. In the future, BLT1 の mobile を suppression す の る molecules with や, he の GPCR に つ い て の beg が 検 necessary で は あ る が, today back to の results が, GPCR の bureau in the sexual に masato す る important な knowledge と な る possibility が あ る.

项目成果

GPCRの時空間的な活性分子機構の解明

阐明GPCR的时空活性分子机制

• 发表时间: 2008
• 作者: 小野原直哉;横溝岳彦
• 通讯作者: 横溝岳彦