蛋白質間相互作用研究におけるGFP-FRET法の汎用化

GFP-FRET 方法在蛋白质-蛋白质相互作用研究中的推广

• 批准号: 12206059
• 负责人: 木俣 行雄
• 金额: --
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12206059/
• 关键词: 緑色蛍光蛋白質; エネルギー転移; 小胞体; データーベース; FRET; EST; GFP; KDEL

本研究では、two hybrid法の代替となる簡便な蛋白質間相互作用解析法の開発と応用を目指した。GFP-FRET法では、波長特性が異なる2種類のGFP改変体それぞれを、試験蛋白質と融合・発現させ、その相互作用をFRET蛍光として評価する。two hybrid法と異なりGFP-FRET法は、原理的にはどのオルガネラでも行える。そこで、小胞体内腔での蛋白質間相互作用を、GFP-FRET法を用いて調べることとした。また、GFP-FRET法の欠点に、2種のGFP改変体が適切な角度と距離で近接しなければ強いFRET蛍光が得られず、試験蛋白質同士が結合してもFRET蛍光を観察できないことがある。本研究では、その欠点の克服も試みた。そこで本研究では第一に、GFP改変体/試験蛋白質間のリンカー配列同士が弱いアフィニティーを持ち、その結果、試験蛋白質同士の結合依存的に、常にGFP改変体同士が適切に配置されるというシステムの開発を行った。そのためまず、分子内GFP-FRETにおいてリンカー候補を2個タンデムに繋げ、強いFRET蛍光が得られるリンカーを選別した。その結果、ロイシンジッパーで2量体を形成すると予測されるある種のポリペプチドが、リンカーとして適切であることが分かった。第二に、GFP-FRET法を用いて小胞体内の蛋白質間相互作用を網羅的に調べる前段階として、新規小胞体蛋白質の同定を行った。方法としては、小胞体残留シグナル(C末端にKDEL)を持つ蛋白質をコードするcDNAを、データーベースから検索した。結果として、3種類の新規小胞体蛋白質を同定できた。今後の課題としてはまず、今回の研究で得たリンカーが、分子間のGFP-FRETにも幅広く使えるかどうか、検討する必要がある。また、そこで汎用化されたGFP-FRET法を用いて、小胞体内での蛋白質ネットワークを明らかにしたい。

In this study, the alternative of two hybrid method and the development of simple protein-protein interaction analysis method were pointed out. The GFP-FRET method includes two types of GFP modifications with different wavelength characteristics: protein fusion, protein development, and interaction. The two hybrid method is different from the GFP-FRET method. Protein interactions in microcellular spaces and GFP-FRET methods In addition, the GFP-FRET method is not suitable for the detection of two kinds of GFP modifications. The angle and distance are close to each other. The intensity of FRET fluorescence is close to each other. The protein homologues are bound to each other. This study is aimed at overcoming the shortcomings of the system. This study was the first to investigate the association between GFP modified proteins and test proteins. The results showed that the association between GFP modified proteins and test proteins was dependent on the association between GFP modified proteins and test proteins. The two groups of GFP-FRET candidates are selected from the group consisting of two groups: GFP-FRET and GFP-FRET The result is that the two quantities are predicted. Second, the GFP-FRET method was used to regulate the interaction between proteins in small cells. Methods: To detect the presence of small cell residues (C-terminal KDEL) in the cDNA and DNA fragments. The results showed that three kinds of new microsomal proteins were identical. Future research has been carried out on GFP-FRET, which is necessary for future research. The GFP-FRET method is widely used in cell biology.

项目成果

Yukio Kimata: "Identification of a novel mammalian endoplasmic reticulum-resident KDEL protein using an EST database motif search"Gene. 261(2). 321-327 (2000)

Yukio Kimata：“使用 EST 数据库基序搜索识别一种新型哺乳动物内质网驻留 KDEL 蛋白”基因。