蛋白質間相互作用研究におけるGFP-FRET法の汎用化

GFP-FRET 方法在蛋白质-蛋白质相互作用研究中的推广

基本信息

批准号：
12206059
负责人：
木俣行雄
金额：
--
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12206059/
关键词：
緑色蛍光蛋白質エネルギー転移小胞体データーベース FRET EST GFP KDEL

项目摘要

本研究では、two hybrid法の代替となる簡便な蛋白質間相互作用解析法の開発と応用を目指した。GFP-FRET法では、波長特性が異なる2種類のGFP改変体それぞれを、試験蛋白質と融合・発現させ、その相互作用をFRET蛍光として評価する。two hybrid法と異なりGFP-FRET法は、原理的にはどのオルガネラでも行える。そこで、小胞体内腔での蛋白質間相互作用を、GFP-FRET法を用いて調べることとした。また、GFP-FRET法の欠点に、2種のGFP改変体が適切な角度と距離で近接しなければ強いFRET蛍光が得られず、試験蛋白質同士が結合してもFRET蛍光を観察できないことがある。本研究では、その欠点の克服も試みた。そこで本研究では第一に、GFP改変体/試験蛋白質間のリンカー配列同士が弱いアフィニティーを持ち、その結果、試験蛋白質同士の結合依存的に、常にGFP改変体同士が適切に配置されるというシステムの開発を行った。そのためまず、分子内GFP-FRETにおいてリンカー候補を2個タンデムに繋げ、強いFRET蛍光が得られるリンカーを選別した。その結果、ロイシンジッパーで2量体を形成すると予測されるある種のポリペプチドが、リンカーとして適切であることが分かった。第二に、GFP-FRET法を用いて小胞体内の蛋白質間相互作用を網羅的に調べる前段階として、新規小胞体蛋白質の同定を行った。方法としては、小胞体残留シグナル(C末端にKDEL)を持つ蛋白質をコードするcDNAを、データーベースから検索した。結果として、3種類の新規小胞体蛋白質を同定できた。今後の課題としてはまず、今回の研究で得たリンカーが、分子間のGFP-FRETにも幅広く使えるかどうか、検討する必要がある。また、そこで汎用化されたGFP-FRET法を用いて、小胞体内での蛋白質ネットワークを明らかにしたい。

这项研究旨在开发和应用一种简单的方法来分析蛋白质与蛋白质相互作用，这可以替代两种混合方法。在GFP-FRET方法中，将两种具有不同波长特征的GFP变体融合并用测试蛋白表达，它们的相互作用被评估为FRET荧光。与两种混合方法不同，GFP-FRET方法可以原理与任何细胞器一起使用。因此，使用GFP-FRET方法研究了内质网中蛋白质 - 蛋白质相互作用。 GFP-FRET方法的另一个缺点是，如果两个GFP变体在适当的角度和距离之间彼此之间不近距离，则无法获得强的FRET荧光，即使测试蛋白结合在一起，也无法观察到FRET荧光。这项研究还试图克服这一缺点。因此，在这项研究中，首先，我们开发了一个系统，在该系统中，GFP变体/测试蛋白之间的接头序列具有较弱的亲和力，因此，GFP变体始终以结合依赖性方式在测试蛋白之间正确布置。因此，首先，将两个接头候选物连接到分子内GFP-FRET中的串联，并选择了可以获得强fret荧光的接头。结果表明，某些预测在亮氨酸拉链处形成二聚体的多肽是适合作为接头的。其次，使用GFP-FRET方法，将新的内质网蛋白的鉴定作为初步步骤，以全面研究内质网中蛋白质 - 蛋白质相互作用。作为一种方法，从数据库中搜索了内质网（C-terminus的KDEL）在内质网处（KDEL）处于残留信号的cDNA。结果，鉴定了三个新型的内质网蛋白。至于未来的挑战，有必要首先考虑本研究中获得的接头是否可以广泛用于分子间GFP-FRET。此外，我们想使用广义GFP-FRET方法阐明内质网中的蛋白质网络。