权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

線維芽細胞の血管内皮細胞への分化誘導メカニズムの解明再生医療への応用を目指して

阐明诱导成纤维细胞分化为血管内皮细胞的机制，旨在再生医学中的应用

基本信息

批准号：
20791310
负责人：
大沼俊名
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20791310/
关键词：
線維芽細胞分化誘導血管内皮細胞 Tie-Gfpマウス角膜基質

项目摘要

【目的】皮下結合組織には神経細胞、筋細胞、骨細胞、軟骨細胞など様々な細胞に分化する多能性幹細胞が存在する。しかし、線維芽細胞が血管内皮細胞に分化するという報告は、これまでほとんどなされていない。したがって、線維芽細胞が血管内皮細胞に分化するメカニズムや生物学的意義も不明である。そこで本研究では線維芽細胞が血管内皮細胞へと分化する際の誘導物質の検索と、その誘導メカニズムを解析することを目的とした。【方法】Tie2-GFPマウスの角膜を採取し、組織片から角膜実質に存在する線維芽細胞を分離・培養した。これとは別にマウスの腫瘍細胞株であるLLCとsarcoma細胞をDMEM/F12(1 : 1, serum free)にて培養し、培養上清を調製した。また、硝酸銀処理により血管新生を誘導したラット角膜をホモジナイズし、血管新生組織由来の組織抽出液として調製した。Tie2-GFP線維芽細胞の培養液中にこれらの培養上清や組織抽出液を添加し、GFPと血管内皮細胞特異的マーカーの発現を蛍光顕微鏡にて解析した。【結果】腫瘍細胞株LLC、sarcomaの培養上清(培養時間24h、48h、72h、96h)を添加した場合、いずれの培養上清によっても角膜線維芽細胞におけるGFP発現量に変化は認められなかった。また、これらの腫瘍細胞株と線維芽細胞の共培養によってもGFPの発現は変化しなかった。一方、血管新生組織由来の組織抽出液を添加した場合添加後24時間でGFPが発現し、これは72時間後まで継続することが確認された。血管内皮マーカーのTie1、Tie2、PECAM1、CD34の免疫染色では、いずれの場合も発現を確認できなかった。【考察】培養上清や共培養と、組織抽出液とでは異なる結果が得られた。これらは両者とも血管新生を誘導する活性があることが知られており、Tie2-GFP線維芽細胞におけるGFPの発現を誘導すると予想された。しかし、組織抽出液でのみGFPの発現が誘導された。腫瘍細胞株は均一の細胞集団からなるのに対して、組織抽出液は様々な細胞集団由来の因子が多数含まれる。今回の結果より、このような単一の細胞種は線維芽細胞を血管内皮には誘導せず、in vivoにおける複雑で多様な要因が関与している可能性が示唆された。

[Objective] Pluripotent stem cells exist in the differentiated cells of neurons, muscle cells, osteocytes, chondrocytes and other tissues in subcutaneous junctional tissues. The differentiation of vascular endothelial cells was reported in this paper. The biological significance of vascular endothelial cell differentiation is unknown. The aim of this study is to analyze the induction of vascular endothelial cell differentiation by vascular germ cells. [Method] The cornea of Tie2-GFP was taken, and the linear germ cells present in the cornea from the tissue slice were isolated and cultured. LLC sarcoma cells were cultured in DMEM/F12(1 : 1, serum free) and the supernatant was conditioned. Silver nitrate treatment induces angiogenesis in the cornea, and tissue extracts from which angiogenesis originates are modulated. Add culture supernatant and tissue extract to culture medium of Tie2-GFP line bud cells, and analyze the development of GFP and vascular endothelial cell-specific cells by light microscopy. [Results] When the supernatant of tumor cell lines LLC and sarcoma was added (culture time 24h, 48h, 72h, 96h), the GFP production of corneal fibroblasts was changed. The development of GFP in co-culture of cell lines and vascular buds was investigated. GFP was detected 24 hours after the addition of the tissue extract from which angiogenesis originated, and was confirmed 72 hours later. Immunostaining for Tie1, Tie2, PECAM1 and CD34 in vascular endothelial cells was performed to confirm the presence of these proteins. [Investigation] Culture supernatant, co-culture, tissue extract, different results. The expression of GFP was detected in Tie2-GFP cells The expression of GFP in tissue extract was induced. The tumor cell lines contain many factors related to the origin of the uniform cell population, and the tissue extracts contain many factors related to the origin of the uniform cell population. The results of this study show that there are many important factors related to the induction of vascular endothelial cells in vivo.