ボツリヌス毒素を用いたシナプトタグミンの可視化とリサイクリング速度の解析

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神経情報処理を恒常的に維持するためには、シナプス伝達が安定して行われる必要がある。伝達物質受容体はシナプス後部にありさえすれば、伝達物質を受容し多かれ少なかれ応答することが出来る。一方、シナプス小胞は内包する伝達物質を放出してしまったらそれで終わりである。そのままでは速やかにシナプス伝達が止まってしまう為、シナプス小胞はリサイクリングされる。シナプス小胞のリサイクリング機構を明らかにすることは、シナプス伝達の恒常性を考える上でも重要な意味を持つだろう。これまで、シナプス小胞のリサイクリングを解析する道具としてFM dye(両親媒性蛍光色素)やSynapto-pHlourin(VAMP2とpH感受性GFPのFusionタンパク)を用いた研究が行われてきた。しかし主にexocytosisまたはendocytosisに着目した研究であり、endocytosisから再放出までの過程(en-rex過程)を詳細に検討した報告は少ない。本研究の目的はこのen-rex過程を解析する方法論を確立することである。この目的のために、ボツリヌス菌毒素Gのシナプトタグミン結合領域を大腸菌生合成系によって作製した。可溶化を促進するようなタグ配列を付加すると、可溶化はされるがこのタグ配列が邪魔をしてシナプトタグミンに結合できない可能性があった。このためタグを単純屏Hisタグとして作製したが全てが不溶化してしまった。この問題を解決する中で、当該部分配列を可溶化するためには1M程度のアルギニンが有効であることが分かった。シナプトタグミン結合領域に蛍光色素を付加し、神経前末端に取り込まれるかどうか実験を行った結果、シナプス前末端には蛍光は観察されなかった。