カルシウムチャネルクラスターが担うシナプス小胞放出への役割の解析

シナプス前終末からのシナプス小胞の開口放出は電位依存性カルシウムチャネルより流入したカルシウムに惹起されており、シナプス前終末における電位依存性カルシウムチャネルの空間配置を明らかにすることは、シナプス伝達の制御機構を解明する上で必要不可欠である。当該年度の研究においては、電位依存性カルシウムチャネルの空間配置の解析と、空間配置を制御する分子基盤の解析を目的とした。まず、電位依存性カルシウムチャネルの空間配置を解析する手法の確立を行った。電位依存性カルシウムチャネルのアルファサブユニットのひとつであるCav2.1を、抗Cav2.1抗体を用いて蛍光色素にて標識した後に、超解像顕微鏡技術を用いて観察することで、約10 nmの解像度で、Cav2.1の空間配置を解析する手法を確立した。確立した手法を用いて電位依存性カルシウムチャネルの空間配置を解析した結果、電位依存性カルシウムチャネルはシナプス前終末において複数のクラスターを形成していることが明らかとなった。続いて、電位依存性カルシウムチャネルとシナプス小胞の放出部位の位置関係を明らかにするために、シナプス小胞の放出部位を構成する分子であるMunc13-1とCav2.1の位置関係を、STORM顕微鏡を用いて解析した。その結果、電位依存性カルシウムチャネルはシナプス小胞の放出部位から40 nm程度の極近傍に配置していることが明らかとなった。以上より明らかとなった電位依存性カルシウムチャネルの空間配置がどのような分子基盤によって制御されているかを明らかにするために、電位依存性カルシウムチャネルとの結合が示されているRim1, RBP2, CAST及びELKSを認識する抗体を入手、あるいは作製した。また、同4遺伝子の発現を抑制するためのshRNAを発現するレンチウイルスベクターを設計・作製した。以上より、電位依存性カルシウムチャネルの空間配置を制御する分子基盤を解析するためのツールの開発を完了した。

シナプス前終末からのシナプス小胞の開口放出は電位依存性カルシウムチャネルより流入したカルシウムに惹起されており、シナプス前終末における電位依存性カルシウムチャネルの空間配置を明らかにすることは、シナプス伝達の制御機構を解明する上で必要不可欠である。当該年度の研究においては、電位依存性カルシウムチャネルの空間配置の解析と、空間配置を制御する分子基盤の解析を目的とした。まず、電位依存性カルシウムチャネルの空間配置を解析する手法の確立を行った。電位依存性カルシウムチャネルのアルファサブユニットのひとつであるCav2.1を、抗Cav2.1抗体を用いて蛍光色素にて標識した後に、超解像顕微鏡技術を用いて観察することで、約10 nmの解像度で、Cav2.1の空間配置を解析する手法を確立した。確立した手法を用いて電位依存性カルシウムチャネルの空間配置を解析した結果、電位依存性カルシウムチャネルはシナプス前終末において複数のクラスターを形成していることが明らかとなった。続いて、電位依存性カルシウムチャネルとシナプス小胞の放出部位の位置関係を明らかにするために、シナプス小胞の放出部位を構成する分子であるMunc13-1とCav2.1の位置関係を、STORM顕微鏡を用いて解析した。その結果、電位依存性カルシウムチャネルはシナプス小胞の放出部位から40 nm程度の極近傍に配置していることが明らかとなった。以上より明らかとなった電位依存性カルシウムチャネルの空間配置がどのような分子基盤によって制御されているかを明らかにするために、電位依存性カルシウムチャネルとの結合が示されているRim1, RBP2, CAST及びELKSを認識する抗体を入手、あるいは作製した。また、同4遺伝子の発現を抑制するためのshRNAを発現するレンチウイルスベクターを設計・作製した。以上より、電位依存性カルシウムチャネルの空間配置を制御する分子基盤を解析するためのツールの開発を完了した。