有機化学的手法と分子生物学的手法を融合させた機能性プローブの開発

结合有机化学和分子生物学方法开发功能探针

基本信息

批准号：
09J00556
负责人：
渡辺修司
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞が生きたまま、生体分子の挙動や局在を可視化する技術はタンパク質の生体内での機能を詳細に明らかにするために極めて有用な手法である。これまでに我々はタンパク質を蛍光性小分子で標識する技術として、β-ラクタマーゼ変異体を用い、β-ラクタム化合物を特異的にラベル化する手法を確立している。これまでに小分子を用いたタンパク質ラベル化法は数多く報告されているが、その殆どは未反応プローブがバックグラウンドとなってしまうために、細胞洗浄が必要であった。そのため細胞小器官などの洗浄の困難な部位への応用や標的タンパク質のリアルタイム解析には限界があった。そこでβ-ラクタムのプロドラッグを用いることで優れた細胞膜透過性を有するラベルプローブを開発した。その高い細胞内集積性を利用することで細胞洗浄操作を行う事無く、細胞内タンパク質の特異的ラベル化に成功している。また新規発蛍光性ラベル化プローブとしてアゾピリジンを脱離基として有するプローブを合成した。新規ラベル化プローブはBL-tagとのラベル化に伴う優れた蛍光応答性を示し、未反応プローブを取り除く事無く標的タンパク質を特異的かつ迅速に可視化することに成功した。そして、分子内塩を形成させることで膜透過性を有しており、未反応プローブ存在下における細胞内タンパク質の特異的ラベル化にも成功している。本研究においてタンパク質蛍光イメージングの基礎技術が確立され、Gタンパク質共役受容体などの創薬に重要なタンパク質の挙動解析を可能にするものと期待される。

可视化生物分子的行为和定位的技术，而生存细胞仍然是非常有用的方法，可详细阐明蛋白质的功能。迄今为止，我们已经建立了一种使用β-内酰胺酶突变体特异性标记β-内酰胺化合物的技术，用于用荧光小分子标记蛋白质。有许多使用小分子标记的蛋白质标记的报道，但是大多数都需要清洗细胞，因为未反应的探针成为背景。因此，应用程序对难以清洁的位点（例如Organelle和目标蛋白的实时分析）存在局限性。因此，通过使用β-内酰胺的前药，我们开发了具有出色细胞膜通透性的标签探针。通过利用其高细胞内积累，它在不进行细胞洗涤操作的情况下成功地标记了细胞内蛋白质。将新的荧光标记的探针与硫吡啶定为离开组合成。新型标记的探针表现出与BL-TAG标记相关的出色荧光响应能力，并且能够明确，快速地可视化目标蛋白，而无需去除未反应的探针。此外，形成分子内盐以提供膜渗透性，并成功实现了未反应探针的情况下细胞内蛋白的特异性标记。这项研究已经建立了基本的蛋白质荧光成像技术，并有望对蛋白质的行为进行分析，这对于药物发现（例如G蛋白偶联受体）很重要。