タンパク質分解経路における初期シグナル付加反応の分子機構の解明

申請者はATELの基質結合部位をアミノ酸配列から予測し、予測される部位に変異を導入し、生化学的解析を行うことにより基質結合部位、活性中心の同定を試みることにしました。ATELはAatとアミノ酸配列の相同性はありますが、基質が異なることが報告されています。申請者は、ATELファミリー、及びATELファミリーと基質結合部位が決定されているAatファミリー間でアミノ酸配列を比較検討し、基質結合部位であると考えられるアミノ酸を21個選択しました。選択したアミノ酸をアラニンに置換し、酵素活性測定からアミノアシルtRNA及び基質ペプチド(ラクトアルブミン)のKm及びVmaxを決定しました。また、ゲルシフトアッセイを用いることによりアミノアシルtRNAに対するKd、クロスリンク法を用いて基質ペプチドへの結合力を明らかにしました。これらの結果から、ATELの基質結合部位及び活性中心を推測することができました。推測された活性中心のアミノ酸はAatファミリーでは保存されていませんが、その他のファミリーであるATE、Bpt、ATELの3つのファミリーにおいて高度に保存されていることから3つのファミリーにおいてすべて同一の反応機構でペプチド結合形成が行われているのではないかと考えています。また、予測される活性中心はアスパラギン酸であったことから、Aatの反応機構である電子伝達系を用いたものではなく、単純に脱プロトン化により酵素反応が進行するのではないかと考えられます。

申請者はATELの基質結合部位をアミノ酸配列から予測し、予測される部位に変異を導入し、生化学的解析を行うことにより基質結合部位、活性中心の同定を試みることにしました。ATELはAatとアミノ酸配列の相同性はありますが、基質が異なることが報告されています。申請者は、ATELファミリー、及びATELファミリーと基質結合部位が決定されているAatファミリー間でアミノ酸配列を比較検討し、基質結合部位であると考えられるアミノ酸を21個選択しました。選択したアミノ酸をアラニンに置換し、酵素活性測定からアミノアシルtRNA及び基質ペプチド(ラクトアルブミン)のKm及びVmaxを決定しました。また、ゲルシフトアッセイを用いることによりアミノアシルtRNAに対するKd、クロスリンク法を用いて基質ペプチドへの結合力を明らかにしました。これらの結果から、ATELの基質結合部位及び活性中心を推測することができました。推測された活性中心のアミノ酸はAatファミリーでは保存されていませんが、その他のファミリーであるATE、Bpt、ATELの3つのファミリーにおいて高度に保存されていることから3つのファミリーにおいてすべて同一の反応機構でペプチド結合形成が行われているのではないかと考えています。また、予測される活性中心はアスパラギン酸であったことから、Aatの反応機構である電子伝達系を用いたものではなく、単純に脱プロトン化により酵素反応が進行するのではないかと考えられます。