ペルオキシソーム内腔タンパク質輸送制御機構の解明

阐明过氧化物酶体腔内蛋白质转运的控制机制

• 批准号: 09J04905
• 负责人: 野口 雅史
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J04905/
• 关键词: ペルオキシソーム; 輸送; レポーター; Pex5p; エクスポート; CHO細胞; 輸送活性

今年度は、本研究において新規に構築したペルオキシソームマトリクスタンパク質輸送効率測定系を用いて様々なアッセイ行った。ペルオキシソームマトリクスタンパク質の受容体Pex5pとPTS1シグナル部を改変した複数のレポータータンパク質との結合強度をin vitroで測定し、それぞれのレポータータンパク質の輸送効率を新規アッセイ系で測定した。その結果、両者には明確な相関があることを定量的に示すことができた。また、Pex11pβ、DLP1G363Dの過剰発現等ペルオキシソーム形態を変化させた条件での輸送効率測定を行ったが、驚くべきことに全く変化が無いことが判明した。ペルオキシソーム形態異常マウスが報告されているが、その症状はペルオキシソームマトリクスタンパク質輸送には起因しないことが示唆される。さらに今年度は、Pex5pのペルオキシソームからのエクスポート反応、またエクスポート促進因子Awp1ついても解析を進めた。In vitro Pex5Pエクスポート反応系において、抗Awp1抗血清添加によるエクスポート阻害効果を見出した。このことにより、Awp1がエクスポート促進に関与することを証明することができた。抗Awp1抗血清をツールとして用いることで、エクスポートステップの詳細な解析が期待される。また、Pex5pのエクスポートにはPex5pのモノユビキチン化が必須であることが報告されているが、モノユビキチン化以降のエクスポートステップはほとんど解析されていない。そこで、Pex5pモノユビキチン化とそれ以降のエクスポートステップを分ける実験系を構築し、モノユビキチン化後にATP加水分解依存でN-Ethylmaleimide感受性のステップが存在することを見出した。

今年，在本研究中，使用新建造的过氧化物酶体蛋白传输效率测量系统进行了各种测定。在体外测量了过氧化物酶体基质蛋白的受体PEX5P和具有改良的PTS1信号转导部分的多个报告蛋白之间的结合强度，并使用新型测定系统测量了每个报告蛋白的转运效率。结果，可以定量地表明两者之间存在明显的相关性。此外，在改变过氧化物酶体形态的条件下测量了运输效率，例如PEX11Pβ和DLP1G363D的过表达，令人惊讶的是，发现根本没有变化。据报道，小鼠是过氧化物酶体的异常形态，表明它们的症状不是由过氧化物酶体基质蛋白转运引起的。此外，今年我们还分析了过氧化物酶体和出口促进因子AWP1的PEX5P输出反应。在体外PEX5P输出反应系统中，发现添加抗Anti-Antiserum的效果被抑制。这证明AWP1参与促进出口。使用抗Antip1抗血清作为工具，将对出口步骤进行详细的分析。此外，据报道，PEX5P的单泛素化对于出口PEX5P至关重要，但是几乎没有分析单泛素化后的出口步骤。因此，我们构建了一个实验系统，该系统将PEX5P单泛素化和随后的输出步骤分开，并发现单次夸夸其胞素化后，有一个ATP水解依赖性的N-乙基甲米酰亚胺敏感的步骤。

项目成果

細胞全蛍光量測定によるペルオキシソームマトリクスタンパク質輸送測定法

使用全细胞荧光测量的过氧化物酶体基质蛋白转运测量方法

• 发表时间: 2011
• 作者: Tomoka Murai;Yukiko Nakase;Keiko Fukuda;Yuji Chikashige;Chihiro Tsutsumi;Yasushi Hiraoka;Tomohiro Matsumoto;野口雅史
• 通讯作者: 野口雅史

AWP1/ZFAND6 Functions in Pex5 Export by Interacting with Cys-Monoubiquitinated Pex5 and Pex6 AAA ATPase

• DOI: 10.1111/j.1600-0854.2011.01298.x
• 发表时间: 2012-01-01
• 期刊: TRAFFIC
• 影响因子: 4.5
• 作者: Miyata, Non;Okumoto, Kanji;Fujiki, Yukio
• 通讯作者: Fujiki, Yukio

Asystem to quantify the import ratio of peroxisomal matrix protein by measuring fluorescence intensity

通过测量荧光强度来定量过氧化物酶体基质蛋白导入率的系统

• 发表时间: 2011
• 作者: Tomoka Murai;Yukiko Nakase;Keiko Fukuda;Yuji Chikashige;Chihiro Tsutsumi;Yasushi Hiraoka;Tomohiro Matsumoto;野口雅史;Tomoka Murai;野口雅史
• 通讯作者: 野口雅史

A System to Quantify the Differential Import of Peroxisomal Matrix Protein by Measuring Fluorescence Intensity

通过测量荧光强度来量化过氧化物酶体基质蛋白差异输入的系统

• 发表时间: 2012
• 作者: Miyata N;Okumoto K;Mukai S;Noguchi M;Fujiki Y.;M.Noguchi
• 通讯作者: M.Noguchi

細胞全蛍光量測定によるペルオキシソームマトリクスタンパク質輸送速度測定法

使用全细胞荧光测量的过氧化物酶体基质蛋白转运速率测量方法

• 发表时间: 2009
• 作者: Ryuichiro Shinohara;Masahiko Isobe;野口雅史;篠原隆一郎;野口雅史;篠原隆一郎;野口雅史;Ryuichiro Shinohara;野口雅史;Ryuichiro Shinohara;野口雅史
• 通讯作者: 野口雅史