セリウム触媒を利用した人工制限酵素の高機能化およびヒトゲノムの遺伝子操作への応用

使用铈催化剂改善人工限制性酶的功能并将其应用于人类基因组的遗传操作

• 批准号: 09J06399
• 负责人: 堅田 仁
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J06399/
• 关键词: 人工制限酵素; ヒトゲノム; 遺伝子組換え; 相同組換え

初年度の研究において、人工制限酵素ARCUTを用いてin vitroでヒトゲノムを位置特異的に切断できること、またARCUTにより標的DNAに二本鎖切断(DSB)を導入することでヒト細胞内での相同組換え(HR)が促進されることを確認した。そこで二年目は、ARCUTによるヒトゲノムの遺伝子組換えを目的とし、HRをより高効率に誘起できる系の構築を目指した。まず、in vitroでDSBを導入したプラスミドを細胞内に導入し、一定時間経過後に抽出してその配列を網羅的に解析した。その結果、HRにより組換わった目的のプラスミドは、全体の10%程度であり、残りの90%はHRではなく、非相同末端結合(NHEJ)により修復されたものであることが判明した。この結果から、より高効率にHRを誘起するために、NHEJによるDSB修復経路を抑制する手法を検討した。まず1点目は細胞周期の同調を利用した手法である。これは、HRが起こりやすくNHEJが起こりにくいとされるG2/M期に細胞を同調することで、相同組換えをより効率的に起こすという試みである。また、2点目はRNAiを利用してNHEJ関連タンパク質をノックダウンする手法である。結果として、いずれの手法を用いた場合においても、NHEJが抑制され、HRが最大2.4に高効率化することに成功した。本研究では、最終的な目標であるヒトゲノムの遺伝子操作に向けて極めて重要な知見が得られた。

在研究的第一年中，我们证实了人工限制酶弧线可以在体外裂解人类基因组，并通过Arcut引入双链断裂（DSB）到靶DNA中，从而促进人类细胞中的同源重组（HR）。因此，在第二年，我们旨在创建一个可以以更高效率诱导人力资源的系统，目的是使用Arcut基因重新组合人类基因组。首先，将带有DSB的质粒引入了体外，在经过一定时间段内提取的细胞中提取了细胞，并全面分析了序列。结果，发现由HR重组的靶质粒约为总数的10％，其余90％通过非同源末端键合（NHEJ）而不是HR修复。基于这些结果，我们研究了一种抑制NHEJ DSB修复途径的方法，以诱导效率更高的HR。第一点是利用细胞周期同步的技术。这是一种尝试在G2/m期间通过同步细胞的同步，在这种情况下可能会发生HR，并且不太可能发生NHEJ。第二点是使用RNAi击倒NHEJ相关的蛋白质。结果，以两种方法，NHEJ被抑制，HR成功增加到最大2.4。这项研究为对人类基因组的遗传操纵的最终目标提供了极为重要的见解。

项目成果

酵素利用技術大系 第4編第2章第3節"変異導入による特異性の改変"

酶利用技术系列第4卷第2章第3节“通过引入突变改变特异性”

• 发表时间: 2010
• 作者: 小宮山眞;堅田仁
• 通讯作者: 堅田仁

人工制限酵素による相同組換えの促進とゲノム工学への応用

利用人工限制性酶促进同源重组及其在基因组工程中的应用

• 发表时间: 2010
• 作者: 堅田仁;小宮山眞
• 通讯作者: 小宮山眞