血小板凝集の機能調節に関わる分子のクローニングとその機能解析

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血小板凝集は止血機能を果たしており、生命維持において重要であるが、過剰な凝集は病的な血栓を形成して様々な循環器疾患(脳梗塞、心筋梗塞など)を引き起こす原因にもなる。血小板凝集にはインテグリンα_<IIb>β_3の活性化が関与しているため、本研究ではヒトの活性型インテグリンを発現させたCHO細胞を用いてインテグリンα_<IIb>β_3の活性化メカニズムに関わる新規シグナル分子の探索及び機能解析をおこなった。2年目である今年度は、PAC-1結合能が低下した変異CHO細胞株にcDNAライブラリを導入し、インテグリンα_<IIb>β_3の活性化に関わる分子のクローニングを試みた。インテグリンの活性化の指標には、ヒトの活性型インテグリンα_<IIb>β_3を認識するPAC-1抗体を用いた。cDNAライブラリを導入後、PAC-1結合能が回復した細胞をCell Sorterを用いて回収し、細胞から導入されたcDNAを回収することで、インテグリンα_<IIb>β_3の活性化に関わるcDNAの特定を試みた。しかし、今回単離した2種類の変異CHO細胞株では、回収したcDNAを変異CHO細胞に再導入してもPAC-1結合能の回復がみられず、インテグリンα_<IIb>β_3の活性化に関わる分子の特定はできなかった。また、今年度はsiRNAライブラリを用いてインテグリンα_<IIb>β_3の活性化に関わる新規分子の同定を試みた。マウスあるいはラットに対するsiRNAライブラリ計590個のsiRNAをそれぞれCHO細胞株に導入してスクリーニングをおこない、PAC-1結合能を70%以下に抑制するsiRNAを54個得ることに成功した。この結果はインテグリンα_<IIb>β_3の活性化メカニズムに関わる新規シグナル分子の存在を示唆するものである。チャイニーズハムスターに対するsiRNAの設計を行い、さらなる検討を行う必要性がある。