原子間力顕微鏡を用いた1分子力学計測によるタンパク質自由エネルギー地形の研究

原子間力顕微鏡(AFM)を用いてタンパク質1分子に外力を加え、メカニカルな力によりタンパク質をアンフォールディングさせることが近年可能になった。本研究はこの手法を駆使し、タンパク質の機械的安定性やその機能との相関を自由エネルギー地形に基づき定量的に理解することを目的とした。タンパク質1分子伸長実験では目的タンパク質を基板-カンチレバー間に強固に結合させる必要がある。従来、固定化には金表面とタンパク質末端部に人工的に導入したシステイン残基とのAu-S結合を利用する方法等が広く用いられてきたが、この方法は内在性システインを含むタンパク質には適さない。そこで、HaloTagを利用したタンパク質の新規固定化方法を考案し、研究期間内に開発に成功した。この新手法により内在性システインを持つタンパク質についても1分子伸長実験を効率的に行えるようになった。これとは別に、腫瘍抑制因子として知られるp53をモデルとして、DNA結合ドメイン(DBD)とリガンドであるDNA、およびN末端領域との相互作用を、AFMによる1分子伸長実験により調べる研究を立ち上げた。フォースカーブに現れるp53DBDのアンフォールディングパターンをプローブとしてDNAの結合を検出できることを発見した(投稿中)。これらにより、タンパク質1分子伸長実験の対象を広げることに成功し、また断片的ではあるが機能に関連する情報を得ることが出来た。本手法、本分野および周辺分野の一層の発展が期待できる成果である。

原子間力顕微鏡(AFM)を用いてタンパク質1分子に外力を加え、メカニカルな力によりタンパク質をアンフォールディングさせることが近年可能になった。本研究はこの手法を駆使し、タンパク質の機械的安定性やその機能との相関を自由エネルギー地形に基づき定量的に理解することを目的とした。タンパク質1分子伸長実験では目的タンパク質を基板-カンチレバー間に強固に結合させる必要がある。従来、固定化には金表面とタンパク質末端部に人工的に導入したシステイン残基とのAu-S結合を利用する方法等が広く用いられてきたが、この方法は内在性システインを含むタンパク質には適さない。そこで、HaloTagを利用したタンパク質の新規固定化方法を考案し、研究期間内に開発に成功した。この新手法により内在性システインを持つタンパク質についても1分子伸長実験を効率的に行えるようになった。これとは別に、腫瘍抑制因子として知られるp53をモデルとして、DNA結合ドメイン(DBD)とリガンドであるDNA、およびN末端領域との相互作用を、AFMによる1分子伸長実験により調べる研究を立ち上げた。フォースカーブに現れるp53DBDのアンフォールディングパターンをプローブとしてDNAの結合を検出できることを発見した(投稿中)。これらにより、タンパク質1分子伸長実験の対象を広げることに成功し、また断片的ではあるが機能に関連する情報を得ることが出来た。本手法、本分野および周辺分野の一層の発展が期待できる成果である。