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哺乳類型糖鎖合成が可能な新規バキュロウイルス遺伝子発現系の開発

开发能够合成哺乳动物型糖链的新型杆状病毒基因表达系统

基本信息

批准号：
10F00513
负责人：
國保健浩
金额：
$ 1.41万
依托单位：
National Agriculture and Food Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

1)ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)由来の糖代謝酵素遺伝子の単離、同定ならびに機能解析昆虫のアセチルグルコサミニダーゼ(GlcNAcase)には、リソソーム(水解小体)局在型(I型)、非局在型(II型)およびHex遺伝子或いはfdl遺伝子にコードされるHex型、FDL型の4つの分子種が知られている。バキュロウイルス遺伝子発現系で汎用されるヨトウガ由来細胞においては、このうち1型酵素遺伝子が未だ単離されておらず構造も未解明であることから、糖鎖修飾経路の解析に必須となる1型酵素遺伝手の単離を試みた。その結果、ヨトウガGlcNAcaseは他の種間との間で保存された活性部位(Gly-Gly-Asp-Glu-Val)を含む586アミノ酸からなる分子(分子量67キロダルトン)であり、タンパク質レベルで50-70%の相同性を示すこと、II型酵素と同様の酵素活性を有するものの至適pHはやや高いこと、またアルカロイド阻害剤(2-ADN)に対して抵抗性であることが確認された。2)昆虫培養細胞を用いたRNA干渉等による糖合成酵素の遺伝子抑制系の確立糖代謝酵素遺伝子の発現の阻害が及ぼす糖構造の変化を解析する上では、近年、他の生物種で汎用されるRNA干渉法(RNAi)が有効であると考えられるが、チョウ目由来の昆虫細胞における効果的な核酸導入法、RNAi干渉法が確立されていないことから、siRNAによるRNA干渉効果について検証した。FDL型酵素を標的とするfdl 2種類のsmall interfering (si)RNA(CACAATGGAGTTGGGTGTGTCGCAAおよびTTTGGAGCTTGAATCTTCGGCTCG、各25塩基対)をweb上のsiRNA設計プログラム(BLOCK-IT RNAi designer)を用いて設計し、二本鎖RNAを調製した(この際、RNA分解反応を回避するため、+鎖側の塩基に化学的な修飾を施した)。この2種のsiRNAをpolyethyleneimmine(PEI)を用いてヨトウガ由来細胞(SF21AE細胞)に導入したところ、そのうち1つで30-200nMの濃度域においてFDLの顕著な発現抑制が認められた。次いでこのsiRNAの干渉作用を30nMの濃度で用いて経時的に解析したところ、導入2日目から4日目の間にFDLの有意な抑制が見られ、チョウ目由来の昆虫細胞で有意な干渉効果を得る条件が確立できた。

The main results are as follows: 1) the origin of glycosylated enzyme spores (Spodoptera frugiperda) can be used to analyze the presence of insect enzymes (GlcNAcase), hydrolytic bodies (hydrolytic bodies), local (type I), non-local (type II), and fdl (type II). The reason for this is that the source of the enzyme, the type 1 enzyme, the enzyme type 1, the enzyme type 1, the type 1 enzyme, the enzyme type 1, the enzyme type 1 The results showed that the active site (Gly-Gly-Asp-Glu-Val) of GlcNAcase and other storage enzymes contained the molecular weight of 586 amino acid, the molecular weight of 67, the homology of 50-70%, the activity of enzyme type II, the activity of isozymes, and the activity of isozymes from isozymes to isozymes of pH. Please check your resistance to 2-ADN and make sure that you are safe. 2) the inhibition system of sugar biosynthesis enzymes in insect culture, such as RNA drying, is used to make sure that the glycosylated enzymes are blocked and the sugar structure is made. In recent years, the RNA drying method (RNAi) has been used for the introduction of nucleic acid, fruit, etc. The RNAi method makes sure that you don't know what to do, and that the siRNA means that you don't know what to do. The results show that you don't know how to do it. FDL-type enzyme siRNA fdl 2 class small interfering (si) RNA (CACAATGGAGTTGGGTGTGTCGCAA enzyme TTTGGAGCTTGACTTGAATCTTCGGCTCG, each 25-year base) on the siRNA design device (BLOCK-IT RNAi designer), ordinary university RNA design lab (international, RNA decomposition countermeasure avoidance test, + basic chemistry repair test). The siRNAs polypyleneimmine (PEI) was inserted into the SF21AE cells (the cells of origin) in the cells of origin (RNAi), and the FDL was detected in the temperature range of 30-200nM in the temperature range of 30-RNA. The effect of the siRNA on the 30nM was analyzed during the test, the 2nd and 4th day of the FDL was intended to suppress the effect, and the cause of the disease was that the insect cell intended to determine the condition.