哺乳類型糖鎖合成が可能な新規バキュロウイルス遺伝子発現系の開発

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1)ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)由来の糖代謝酵素遺伝子の単離、同定ならびに機能解析昆虫のアセチルグルコサミニダーゼ(GlcNAcase)には、リソソーム(水解小体)局在型(I型)、非局在型(II型)およびHex遺伝子或いはfdl遺伝子にコードされるHex型、FDL型の4つの分子種が知られている。バキュロウイルス遺伝子発現系で汎用されるヨトウガ由来細胞においては、このうち1型酵素遺伝子が未だ単離されておらず構造も未解明であることから、糖鎖修飾経路の解析に必須となる1型酵素遺伝手の単離を試みた。その結果、ヨトウガGlcNAcaseは他の種間との間で保存された活性部位(Gly-Gly-Asp-Glu-Val)を含む586アミノ酸からなる分子(分子量67キロダルトン)であり、タンパク質レベルで50-70%の相同性を示すこと、II型酵素と同様の酵素活性を有するものの至適pHはやや高いこと、またアルカロイド阻害剤(2-ADN)に対して抵抗性であることが確認された。2)昆虫培養細胞を用いたRNA干渉等による糖合成酵素の遺伝子抑制系の確立糖代謝酵素遺伝子の発現の阻害が及ぼす糖構造の変化を解析する上では、近年、他の生物種で汎用されるRNA干渉法(RNAi)が有効であると考えられるが、チョウ目由来の昆虫細胞における効果的な核酸導入法、RNAi干渉法が確立されていないことから、siRNAによるRNA干渉効果について検証した。FDL型酵素を標的とするfdl 2種類のsmall interfering (si)RNA(CACAATGGAGTTGGGTGTGTCGCAAおよびTTTGGAGCTTGAATCTTCGGCTCG、各25塩基対)をweb上のsiRNA設計プログラム(BLOCK-IT RNAi designer)を用いて設計し、二本鎖RNAを調製した(この際、RNA分解反応を回避するため、+鎖側の塩基に化学的な修飾を施した)。この2種のsiRNAをpolyethyleneimmine(PEI)を用いてヨトウガ由来細胞(SF21AE細胞)に導入したところ、そのうち1つで30-200nMの濃度域においてFDLの顕著な発現抑制が認められた。次いでこのsiRNAの干渉作用を30nMの濃度で用いて経時的に解析したところ、導入2日目から4日目の間にFDLの有意な抑制が見られ、チョウ目由来の昆虫細胞で有意な干渉効果を得る条件が確立できた。