X線結晶構造解析による膜を介した電子トランスポーター、DsbDの作動原理の解明

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本年度は、大腸菌由来のDsbDと好熱菌由来のホモログであるCcdAについて、大腸菌の発現系を構築し、詳細な精製の検討を行った。膜タンパク質の精製に必要不可欠な界面活性剤の検討では、DsbD、CcdAともに、炭素鎖9個で構成されるNonyl-Glucoside以下の炭素数の界面活性剤では非常に不安定であることが明らかになった。また炭素鎖10個のDecyl-Maltosideを使うと、最も精製度が高く、結晶化に適していることが分かった。DsbDとDsbC複合体での結晶構造を明らかにするために、DsbCの大腸菌での発現系構築に着手し、～10mg/L-cultureの高い発現量から、高い純度のDsbCを精製することができた。また、DsbDとDsbCの複合体を安定化するために、それぞれの活性中心のシステインを1つずつ欠損させ、電子を受け渡す反応中間体でジスルフィド結合を形成し、安定化する変異体を作製した。ジスルフィド結合を促進する酸化剤と反応時間を詳細に検討し、DsbD-DsbC複合体を安定にかつ、高純度で精製することができた。またDsbD、CcdAとチオレドキシンの複合体の構造解析を行うために大腸菌と好熱菌のチオレドキシンの大腸菌での発現系(～20mg/L-culture)を構築した。どちらのチオレドキシンも高純度で精製することができ、DsbD・CcdAと電子の交換反応を行うことのできる機能的なチオレドキシンであることを確認した。DsbD単独、DsbD-Dsbc複合体の2つについて、低分解能(10Å以下)ながら結晶を得ることができた。