Wnt/Rorシグナルによる免疫系の制御及びその破綻による疾患の解析

本研究は主にWnt5a/Ror2シグナル伝達が免疫システムに与える影響を調べることを目的としている。現在までに野生型及びRor2遺伝子欠損マウスの胎児を用いて、胎児の腸管におけるRor2の発現状態を電子顕微鏡を用いて解析を試みた。また、Wnt5a/Ror2シグナル伝達による絨毛形成や細胞内輸送に重要なIFT20の発現制御に関する研究を引き続き行った。さらにWnt5a/Ror2をknock-downしたSaOS2細胞におけるIFT20のmRNA発現量が優位に低下していることを見出した。IFT20のプロモーター配列解析をしたところ、IFT20の発現にはAP-1結合サイトが重要であることを明らかにした。Wnt5a/Ror2シグナルに依存したAP-1タンパク複合体がIFT20の発現制御に重要であることがChIP解析によって明らかにされた。SaOS2細胞に発現するIFT20をknock-downするとWnt5a/Ror2シグナルによって誘導されるMMP13の発現量が優位に低下していることがを明らかにした。昨年度中はIFT20knock-downSaOS2細胞の浸潤能について評価し、低下することが分かった。そのメカニズムをIFT20がRor2・MMP13のinvadopodiaへの輸送に関わると考え、免疫染色法を用いてIFT20とRor2もしくはMMP13のinvadopodiaにおける共局在している様子を観察した。IFT20がWnt5a/Ror2シグナル伝達に与える影響の一般性を確かめるためにA431ヒト上皮様細胞癌由来細胞株を用いて実験を行った。A431及びA431-Snail細胞のIFT20の発現について検討し、IFT20knockdownA431-Snail細胞においてWnt5a/Ror2シグナル伝達によって誘導されるMMP2発現の発現量と細胞浸潤能について評価を行った。A431-Snail細胞においてIFT20はWnt5a/Ror2シグナルに非依存的に発現するが、Wnt5a/Ror2/MMP2のシグナル伝達に寄与し、SaOS2細胞の場合と同様に細胞浸潤に重要である事がわかった。Wnt5a/Ror2/IFT20シグナル伝達の詳細を調べるためにRor2の欠失変異体と点変異体をIFT20との共沈実験に用い、Ror2のC端にあるプロリンリッチの領域及びその近くにあるチロシン残基のリン酸が結合に重要であることがわかった。この実験の過程の中でIFT20のC端にあるチロシン残基のリン酸化がIFT20の細胞内での安定性に寄与することがわかった。

本研究は主にWnt5a/Ror2シグナル伝達が免疫システムに与える影響を調べることを目的としている。現在までに野生型及びRor2遺伝子欠損マウスの胎児を用いて、胎児の腸管におけるRor2の発現状態を電子顕微鏡を用いて解析を試みた。また、Wnt5a/Ror2シグナル伝達による絨毛形成や細胞内輸送に重要なIFT20の発現制御に関する研究を引き続き行った。さらにWnt5a/Ror2をknock-downしたSaOS2細胞におけるIFT20のmRNA発現量が優位に低下していることを見出した。IFT20のプロモーター配列解析をしたところ、IFT20の発現にはAP-1結合サイトが重要であることを明らかにした。Wnt5a/Ror2シグナルに依存したAP-1タンパク複合体がIFT20の発現制御に重要であることがChIP解析によって明らかにされた。SaOS2細胞に発現するIFT20をknock-downするとWnt5a/Ror2シグナルによって誘導されるMMP13の発現量が優位に低下していることがを明らかにした。昨年度中はIFT20knock-downSaOS2細胞の浸潤能について評価し、低下することが分かった。そのメカニズムをIFT20がRor2・MMP13のinvadopodiaへの輸送に関わると考え、免疫染色法を用いてIFT20とRor2もしくはMMP13のinvadopodiaにおける共局在している様子を観察した。IFT20がWnt5a/Ror2シグナル伝達に与える影響の一般性を確かめるためにA431ヒト上皮様細胞癌由来細胞株を用いて実験を行った。A431及びA431-Snail細胞のIFT20の発現について検討し、IFT20knockdownA431-Snail細胞においてWnt5a/Ror2シグナル伝達によって誘導されるMMP2発現の発現量と細胞浸潤能について評価を行った。A431-Snail細胞においてIFT20はWnt5a/Ror2シグナルに非依存的に発現するが、Wnt5a/Ror2/MMP2のシグナル伝達に寄与し、SaOS2細胞の場合と同様に細胞浸潤に重要である事がわかった。Wnt5a/Ror2/IFT20シグナル伝達の詳細を調べるためにRor2の欠失変異体と点変異体をIFT20との共沈実験に用い、Ror2のC端にあるプロリンリッチの領域及びその近くにあるチロシン残基のリン酸が結合に重要であることがわかった。この実験の過程の中でIFT20のC端にあるチロシン残基のリン酸化がIFT20の細胞内での安定性に寄与することがわかった。