燐酸化と共役したグループ輸送機構の構造的基盤の解明

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燐酸化と共役したグループ輸送機構の構造的基盤を解明するため,ホスホエノールピルビン酸糖燐酸転移システム(PTS)を構成する5つのドメインのうち,グループ輸送を担うEnzyme IICドメインのX線結晶構造解析に取り組んできた.一昨年度に行った結晶化に適する高発現量かつ単分散性と安定性の高いホモログの探索および結晶化により得られた2種のEnzyme IICドメインに対して一時配列から表面電荷を予測し,予測結果からエントロピーを下げる変異体を30種作成,それぞれの変異体について25種を超える界面活性剤に対して可溶化された状態における単分散性と安定性の評価を行った.高い単分散性と安定性を示した変異体と界面活性剤の組み合わせに対しては結晶化スクリーニングを行い,結晶が得られた条件については最適化を進めた.加えて結晶の脱水処理やグルタルアルデヒドによる架橋反応などを用いて結晶性の向上を行うことで,大型放射光施設におけるX線回折実験により,最大で分解能3.6Aのデータセットを得ることに成功した.本研究では更なる分解能向上のため結晶化の際のバインディングパートナーの探索も行った.一つ目に阻害剤の探索を行い,現在までに16種の構造安定化に寄与する阻害剤を得た.二つ目に抗体の作成を行った.三つ目に,Enzyme IIC特異的Monobodyのスクリーニングを行った.現在までにスクリーニングによって2種のMonobodyが見つけ出されている.これらとの共結晶化により,最大で分解能3.6Aのデータセットを得ることに成功している.また,本研究において,蒸気拡散法のみならず,目的の膜タンパク質を脂質に再構成し,結晶化を行うLCP法も導入した.脂質にはモノオレインを用い,現在までに分解能25Aの反射像を与える結晶を得ている.