tRNA揺らぎ塩基のカルボキシメチルアミノメチル化反応機構の構造機能解析

RNAの切断・修飾に関わる2種の酵素遺伝子をpETベクターに導入して、大腸菌内で共発現させた。HiTrapHeparinによる群特異的アフィニティクロマトグラフィーおよびResourceQによる陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。2種のタンパク質は精製過程で常に複合体を形成していた。精製サンプルは限外濾過器によって10mg/ml以上に濃縮し、ヌクレオチド存在下で結晶化スクリーニングに用いた。結晶が得られた条件を最適化することで、回折実験に適したサイズにまで成長させた。大型放射光施設Photon factoryにおいて、回折実験を行い分解能2.5Aのデータを得た。回折データの指数付け、積分をプログラムHKL2000によって行い、プログラムMolRepを用いた分子置換法によって位相を決定した。位相決定により得られた電子密度に対してプログラムCootを用いてモデルを構築し、プログラムCNSによってモデルを精密化した。2種のタンパク質からなる複合体は結合面近傍に形成されるクレバスを有していた。この部分には正電荷が広く分布しており、RNAが結合することが推測された。クレバスの底に相当する部分に2分子のヌクレオチドが結合していた。2つのヌクレオチド結合部位は非常に近いことから、ヌクレオチドの結合様式の一部が実際のRNAの一部の結合様式を模倣している可能性が示唆された。複合体を形成する2つのタンパク質の内の1つは、他のRNA結合タンパク質と3次構造上の相同性を有しており、他のタンパク質においてRNAが結合している領域に相当する部分がクレバスの形成に関与していた。この結果は複合体において形成されているクレバスがRNAを結合する可能性を支持している。

RNAの切断・修飾に関わる2種の酵素遺伝子をpETベクターに導入して、大腸菌内で共発現させた。HiTrapHeparinによる群特異的アフィニティクロマトグラフィーおよびResourceQによる陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。2種のタンパク質は精製過程で常に複合体を形成していた。精製サンプルは限外濾過器によって10mg/ml以上に濃縮し、ヌクレオチド存在下で結晶化スクリーニングに用いた。結晶が得られた条件を最適化することで、回折実験に適したサイズにまで成長させた。大型放射光施設Photon factoryにおいて、回折実験を行い分解能2.5Aのデータを得た。回折データの指数付け、積分をプログラムHKL2000によって行い、プログラムMolRepを用いた分子置換法によって位相を決定した。位相決定により得られた電子密度に対してプログラムCootを用いてモデルを構築し、プログラムCNSによってモデルを精密化した。2種のタンパク質からなる複合体は結合面近傍に形成されるクレバスを有していた。この部分には正電荷が広く分布しており、RNAが結合することが推測された。クレバスの底に相当する部分に2分子のヌクレオチドが結合していた。2つのヌクレオチド結合部位は非常に近いことから、ヌクレオチドの結合様式の一部が実際のRNAの一部の結合様式を模倣している可能性が示唆された。複合体を形成する2つのタンパク質の内の1つは、他のRNA結合タンパク質と3次構造上の相同性を有しており、他のタンパク質においてRNAが結合している領域に相当する部分がクレバスの形成に関与していた。この結果は複合体において形成されているクレバスがRNAを結合する可能性を支持している。