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tRNA揺らぎ塩基のカルボキシメチルアミノメチル化反応機構の構造機能解析

tRNA波动碱基羧甲基氨基甲基化反应机制的结构和功能分析

基本信息

批准号：
10J08966
负责人：
大澤拓生
金额：
$ 1.79万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J08966/
关键词：
RNA tRNA modification tRNA修飾

项目摘要

RNAの切断・修飾に関わる2種の酵素遺伝子をpETベクターに導入して、大腸菌内で共発現させた。HiTrapHeparinによる群特異的アフィニティクロマトグラフィーおよびResourceQによる陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。2種のタンパク質は精製過程で常に複合体を形成していた。精製サンプルは限外濾過器によって10mg/ml以上に濃縮し、ヌクレオチド存在下で結晶化スクリーニングに用いた。結晶が得られた条件を最適化することで、回折実験に適したサイズにまで成長させた。大型放射光施設Photon factoryにおいて、回折実験を行い分解能2.5Aのデータを得た。回折データの指数付け、積分をプログラムHKL2000によって行い、プログラムMolRepを用いた分子置換法によって位相を決定した。位相決定により得られた電子密度に対してプログラムCootを用いてモデルを構築し、プログラムCNSによってモデルを精密化した。2種のタンパク質からなる複合体は結合面近傍に形成されるクレバスを有していた。この部分には正電荷が広く分布しており、RNAが結合することが推測された。クレバスの底に相当する部分に2分子のヌクレオチドが結合していた。2つのヌクレオチド結合部位は非常に近いことから、ヌクレオチドの結合様式の一部が実際のRNAの一部の結合様式を模倣している可能性が示唆された。複合体を形成する2つのタンパク質の内の1つは、他のRNA結合タンパク質と3次構造上の相同性を有しており、他のタンパク質においてRNAが結合している領域に相当する部分がクレバスの形成に関与していた。この結果は複合体において形成されているクレバスがRNAを結合する可能性を支持している。

RNA cleavage and modification are related to the introduction of two enzyme genes into E. coli. HiTraparin is a group of unique products that are refined and refined by ResourceQ. Two kinds of complex are often formed in the process of purification. Purified liquid can be concentrated in excess of 10mg/ml through an external filter. Crystallization can be carried out in the presence of water. Crystallization conditions are optimized for growth. Large radiation facility Photon factory, folding machine, line decomposition energy of 2.5A In addition, the index and integral of the regression equation are determined by molecular substitution method. The phase determination method is used to construct and refine the electron density and CNS structure. Two kinds of complexes were formed near the binding surface. This part of the positive charge distribution, RNA binding, is presumed to be The base of the molecule corresponds to a combination of two molecules. 2. The binding sites of the RNA molecules are very close to each other. The possibility that one part of the binding pattern of the RNA molecules mimics the other part of the binding pattern of the RNA molecules is shown. Complex formation: the first part of the complex formation, the second part of the RNA binding complex formation, the third part of the structure identity, the third part of the RNA binding complex formation, the third part of the complex formation, the third part of the RNA binding complex formation, the third part of the complex formation. These results support the possibility of complex formation and RNA binding.