トキシコゲノミクスによる新規機能性ナノ高分子(デンドリマー)の毒性評価

使用毒物基因组学评估新型功能纳米聚合物（树枝状聚合物）的毒性

基本信息

批准号：
21656129
负责人：
岡部聡
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

PAMAM(polyamidoamine)デンドリマーの生物学的活性は世代が大きくなる程高くなるため、毒性は世代に強く依存すると考えられる。世代依存毒性を含むPAMAMデンドリマーの毒性のより詳細な解明が必須であり、本研究ではPAMAMデンドリマーの毒性及びその発現メカニズムの解明を目的とした。ヒト肝癌由来細胞株HepG2細胞を用いて、PAMAMデンドリマーG4-G7の毒性評価を行った。全ての試験通して、PAMAMデンドリマーとBSAの相互作用による影響を除く為、PAMAMデンドリマーの溶媒にHBSS(Hank's balanced salt solution)にHEPESを10mMとなるように加えたものを用いた。また、暴露濃度にはNeutral red(NR)assayで細胞生存率が80%となる濃度をそれぞれ用いた。その結果、PAMAMデンドリマーの世代依存的な細胞毒性を確認した。同じNR assayで細胞生存率が80%となる濃度でも、世代の大きいPAMAMデンドリマーほどROSの産生能が高いことが明らかとなった。ROS産生は120minで最高値をとった。さらに、DNA損傷性を評価するために、H_2O_2をPositive Controlとしてコメットアッセイを行った。実験結果の解析は、尾の長さ、面積、濃さにより、尾の無いもの(I)から,核内のDNA全てが断片化した頭部の無いものあるいは頭部の極微少なもの(V)までI～Vの5段階に分けて評価した。その結果、AMAMデンドリマーで処理していないHBSS(negative control)の細胞群では、クラスIが大部分であった(75.2%)のに対し、PAMAMデンドリマー暴露系ではクラスIが40%～55%と低く、G7で最低値の40.4%%となった。また、G6,G7では損傷の重篤であるIV,Vの割合が高く、コメット値はG5を除いて世代が増加するに従い、増加する傾向が認められた。以上の結果より、PAMAMデンドリマーがDNA損傷性を有しており、DNA損傷の程度は世代が大きい程より重篤であることが明らかとなった。また、1mM H_2O_2とPAMAMデンドリマーG6はROS産生量がほぼ同程度であったにも関わらず、DNA損傷レベルはH_2O_2の方がPAMAMデンドリマーに比べかなり高い値となった。このことから、酸化ストレスがPAMAMデンドリマーの毒性の直接的な原因ではない可能性が示唆された。

PAMAM（聚酰胺）树突聚合物的生物学活性随着产生的增加而增加，因此毒性被认为高度依赖于产生。至关重要的是要阐明PAMAM树状聚合物的毒性，包括产生依赖性毒性，这项研究旨在阐明PAMAM树状聚合物及其表达机制的毒性。 HEPG2细胞是一种人肝癌衍生的细胞系，用于评估PAMAM树状聚合物G4-G7的毒性。通过所有测试，将HEPE添加到HBSS（Hank的平衡盐溶液）中，以消除PAMAM Dendrrimer和BSA之间相互作用的影响。此外，暴露的浓度是中性红（NR）测定的浓度，其细胞存活率为80％。结果，证实了PAMAM树突聚合物的产生依赖性细胞毒性。已经揭示了，即使在相同的NR分析的细胞活力速率为80％的浓度下，PAMAM树枝状聚合物的ROS产生能力越高。 ROS产量在120分钟时达到其最高值。此外，为了评估DNA损伤，使用H_2O_2作为阳性对照进行了彗星测定。对实验结果的分析进行了五个级别的评估，从嘲讽（i）到无头（无头）或很小的无头（v），所有DNA碎裂了所有DNA，或者取决于尾巴的长度，面积和密度，无头（V）。结果，I类是未用AMAM树状聚合物（75.2％）处理的HBSS（阴性对照）细胞中的大多数，而PAMAM Dendrrrimer暴露的系统中的I类低40％至55％，最低值为G7的40.4 %%。此外，在G6和G7中，严重损伤IV和V的比例很高，除G5以外，Camet值往往会增加。以上结果表明，PAMAM树枝状聚合物会受到DNA的破坏，并且随着发电的增加，DNA损伤的程度更为严重。此外，尽管ROS产生了1 mM H_2O_2和PAMAM Dendrrimer G6，但H_2O_2的DNA损伤水平明显高于PAMAM Dendrrimers。这表明氧化应激可能不是PAMAM树枝状聚合物毒性的直接原因。