超分子化学/遺伝子工学融合による人工アロステリック酵素の開発

通过超分子化学/基因工程融合开发人工变构酶

• 批准号: 21656213
• 负责人: 山口 猛央
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21656213/
• 关键词: アロステリック効果; P450; クラウンエーテル; NIPAM; コンジュゲイション; 分子認識; 超分子化学; 遺伝子工学

生体内に存在するアロステリック酵素は、分子シグナルにより活性を厳密に制御され、生体恒常性を保つ鍵分子である。本研究ではこの機能に創発され、特定イオンを認識して膨潤・収縮するイオン認識応答ポリマー(分子認識ユニット)と、酸化還元酵素であるシトクロムP450(酵素ユニット)のコンジュゲイションを実現し、イオンシグナルにより自身の触媒活性を自律的に制御する人工アロステリック酵素を創製することを目的として研究を行った。本研究実現の鍵は、P450camの触媒活性を維持しながら、反応部位付近にイオン認識ポリマーを結合する厳密なナノ構造制御である。遺伝子工学的手法を利用し、不要なシステイン残基をセリン残基に置き換え、新たに反応活性部位付近にシステインを導入した組み換え体P450camを大量精製するスキームを確立した。さらに、末端にビニルスルホン基を持つイオン認識ポリマーを重合した。両者をコンジュゲイションする手法を、(1)温度、(2)pH、(3)ジビニルスルホン添加量、(4)還元剤添加量などを変えて検討した。GPC、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MSなどによって、コンジュゲイト前後の分子量を比較することによって、確かにコンジュゲイションの確認を行った。この中でも、特にチオール基の定量を行うことによって、コンジュゲイションが起こることを確認した。さらに人工アロステリック酵素の酵素活性を測定した。この結果ナトリウム環境下とカリウム環境下で、酵素活性が10%程度変化した。本研究のコンセプトの基本コンセプトを示すことができた。今後、人工アロステリック酵素の反応メカニズムを解明するために、共鳴ラマンスペクトル、ESR(電子スピン共鳴)、UV-visスペクトルなどの測定により、野生型・変異型・コンジュゲイトにおいて、反応中心のヘム鉄がどのような影響を受けるか、あるいは酵素近傍の水の状態がどう変化するか、あるいはポリマーの膨潤・収縮による基質の接近阻害効果はどのように効果を発揮しているか、などを検証することによって、更なる研究の深化が可能になると考えられる。これにさらにフィードバックをかけることによって、より大きな酵素活性の差を生みだす分子設計が可能になる。

Born in vivo に exist す る ア ロ ス テ リ ッ は ク enzyme, molecular シ グ ナ ル に よ り active を 厳 dense に suppression さ れ, raw volume constancy を keep つ key element で あ る. This study で は こ の function に gen 発 さ れ, specific イ オ ン を know し て swelling, 収 shrinkage す る イ オ ン know 応 answer ポ リ マ ー (molecular recognition ユ ニ ッ ト) と, acidification and yuan enzyme で あ る シ ト ク ロ ム P450 enzymes (ユ ニ ッ ト) の コ ン ジ ュ ゲ イ シ ョ ン を be し, イ オ ン シ グ ナ ル に よ り itself の catalytic activity を self-discipline に suppression す る artificial ア ロ ス テ リ ッ ク enzyme を created す る こ と を purpose と し を line っ て research た. This research be presently の key は, P450cam の catalytic activity を maintain し な が ら and anti 応 paying nearly に イ オ ン know ポ リ マ ー を combining す る 厳 dense な ナ ノ structure system of imperial で あ る. But 伝 sub engineering technique using を し, don't な シ ス テ イ ン residues を セ リ ン residues に き え change, new た に anti 応 active site pay nearly に シ ス テ イ ン を import し み た group in え body P450cam を lots of refined す る ス キ ー ム を establish し た. Youdaoplaceholder0, the end にビニ にビニ ス ス ホ ホ ホ <s:1> base を support を <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> recognize ポリ ポリ を を を overlap た た. That struck the を コ ン ジ ュ ゲ イ シ ョ ン す る を, (1) temperature, pH, (2) (3) ジ ビ ニ ル ス ル ホ ン adding amount, (4) yuan one added quantity な ど を - え て beg し 検 た. GPC, sds-page, MALDI - TOF - MS な ど に よ っ て, コ ン ジ ュ ゲ イ ト の molecular weight を comparison before and after す る こ と に よ っ て, indeed か に コ ン ジ ュ ゲ イ シ ョ ン の confirm line を っ た. In こ の で も, に チ オ ー ル base line の quantitative を う こ と に よ っ て, コ ン ジ ュ ゲ イ シ ョ ン が up こ る こ と を confirm し た. Youdaoplaceholder0 artificial アロステリッ enzyme and pipette activity を determination た た. The <s:1> <s:1> results showed that in the ナトリウム environment and the とカリウム environment, the で and the が10% degree of enzyme activity changed by た. This study コ コ セプト セプト <s:1> basically コ セプトを セプトを shows す とがで とがで た た た た. In the future, artificial ア ロ ス テ リ ッ の ク enzyme reverse 応 メ カ ニ ズ ム を interpret す る た め に, empathy ラ マ ン ス ペ ク ト ル, the ESR (electron ス ピ ン resonance), UV - vis ス ペ ク ト ル な ど の determination に よ り, wild type - alien · コ ン ジ ュ ゲ イ ト に お い て, anti 応 center の ヘ ム iron objects が ど の よ う な を by け る か, あ る い Nearly alongside の は enzyme water の state が ど う variations change す る か, あ る い は ポ リ マ ー の swelling, 収 shrinkage に よ る matrix の close to resistance against unseen fruit は ど の よ う に unseen fruit を 発 swing し て い る か, な ど を 検 card す る こ と に よ っ て, more な る study deepening の が may に な る と exam え ら れ る. こ れ に さ ら に フ ィ ー ド バ ッ ク を か け る こ と に よ っ て, よ り big き な enzyme activity の born poor を み だ す が molecular design may に な る.

项目成果

Prediction of Self-Diffusivity in Multicomponent Polymeric Systems Using Shell-Like Free Volume Theory

• DOI: 10.1021/ie101299q
• 发表时间: 2010-10
• 期刊: Industrial & Engineering Chemistry Research
• 影响因子: 4.2
• 作者: H. Ohashi;Taichi Ito;Takeo Yamaguchi

ミクロ細孔を利用した高分子機能の発現～燃料電池用電解質膜から生体システム発想材料まで～

利用微孔表达聚合物功能 - 从燃料电池的电解质膜到设计生物系统的材料 -

• 发表时间: 2010
• 作者: S. Maeda;S. Sumiya;J. Kasahara;and A. Matsuo;山口猛央
• 通讯作者: 山口猛央

超耐熱性Laccaseを用いたバイオ燃料電池カソードの開発

使用超耐热漆酶开发生物燃料电池阴极

• 发表时间: 2010
• 作者: 金子亮太郎;横田茂;荒川義博;他;杉山朋晴・田巻孝敬・大橋秀伯・山口猛央
• 通讯作者: 杉山朋晴・田巻孝敬・大橋秀伯・山口猛央

Reverse Response of an Ion-Recognition Polyampholyte to Specific Ion Signals at Different pHs

• DOI: 10.1021/ma801936t
• 发表时间: 2009-01
• 期刊: Macromolecules
• 影响因子: 5.5
• 作者: Nobuo Hara;H. Ohashi;Taichi Ito;Takeo Yamaguchi

アロステリック効果を持つ分子認識ポリマー・酵素コンジュゲート体の開発

具有变构效应的分子识别聚合物/酶缀合物的开发

• 发表时间: 2009
• 作者: K. Ogi;T. Okabe;M. Takahashi;S. Yashiro;A. Yoshimura;T. Ogasawara;大柴雄平・田巻孝敬・大橋秀伯・伊藤大知・平川秀彦・山口哲志・長棟輝行・山口猛央
• 通讯作者: 大柴雄平・田巻孝敬・大橋秀伯・伊藤大知・平川秀彦・山口哲志・長棟輝行・山口猛央