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細胞内オルガネラ膜トランスポーター活性の定量的可視化による薬物の細胞毒性評価

通过细胞内细胞器膜转运蛋白活性的定量可视化评估药物细胞毒性

基本信息

批准号：
21659038
负责人：
玉井郁巳
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では細胞内での医薬品動態を解析するために、蛍光プローブを用いた可視化によるin vitro評価系の樹立を試みた。医薬品の多くは胆汁中に排泄されるがその過程には肝胆管腔側細胞膜に複数のABCトランスポーターが介在する。医薬品ならびにその抱合代謝物の胆汁中排泄にはMRP2(ABCC2)が介在するため、併用薬物や病態などによるその活性変動は医薬品の肝動態変化に伴う肝蓄積性など悪影響を及ぼす可能性がある。そこで昨年度に引き続き、細胞内のエステラーゼによりMRP2の蛍光基質のCDFへ変換されるエステル体CDFDAを用いた解析を進めた。細胞接着部分に胆管腔を形成するサンドイッチ培養ラット肝細胞(SCRH)を利用し、肝実質細胞内から胆管腔へのCDF移行を蛍光顕微鏡下で経時的に観察する方法論の樹立を行った。その結果、蛍光顕微鏡観察下、CDFの胆管腔内への蓄積性を時間依存的に検出し、しかもその活性を定量化することに成功し、Drug Metab.Disps.誌にその成果が受理されるに至った。さらに、胆汁うっ滞等毒性と関連する可能性のある胆汁酸排泄に働くトランスポーターBSEPについても同様な解析をすべく、新しいBSEP輸送解析プローブ基質の探索ならびに新規合成を進めた。その結果、dihydrofluorescein diacetateがラットBsep機能解析を上記と同様な手法で進めることが可能であることを見いだした。しかし、ヒトBSEP解析には不充分なため、新たなプローブ基質の探索と新規合成を展開している。本研究で樹立した手法により、胆管側膜ABCトランスポーダーの活性を定量的に解析することが可能になり、今後は各トランスポーター選択的プローブ基質探索・合成により細胞内で機能する多様なトランスポーターの輪送活性評価への応用の可能性を示すことができた。

This study attempts to analyze the dynamics of intracellular drugs and to visualize them in vitro. Many drugs are excreted in the bile and are mediated by multiple ABC channels on the cell membrane of the hepatobiliary lumen. Biliary excretion of drug metabolites is mediated by MRP2 (ABCC2), and the activity of drug metabolites and pathologies is affected by hepatic dynamic changes associated with hepatic accumulation. In addition, the CDF of MRP2 and CDF of CDF are used to analyze CDF. We have established a methodology for using Sandend-Itch cultured hepatocytes (SCRH) to form the bile duct lumen next to the cells, and for observing the migration of CDF inside the hepatocytes and into the bile duct lumen during the day under a light microscope. The results of this study were successfully evaluated by microscopy, time-dependent detection of the accumulation of CDF in bile duct lumen, quantification of its activity, and acceptance of the results of Drug Metab.Disps. Bile acid excretion, bile acid transport, bile acid transport, bile As a result, difluororesin acetate can be used to analyze the function of Bsep. BSEP analysis is not sufficient, new matrix exploration and new synthesis are carried out. In this study, we established a methodology for quantitative analysis of the activity of ABC protein in the bile duct lateral membrane, and demonstrated the possibility of exploring and synthesizing substrates for future selection of various types of protein.