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ペリプラズム酸化還元酵素によるサルモネラ属細菌の病原性発現に関する研究

沙门氏菌周质氧化还原酶致病力表达研究

基本信息

批准号：
22790414
负责人：
三木剛志
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22790414/
关键词：
サルモネラ酸化還元酵素 DsbA 病原性

项目摘要

Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2株のDsbAアミノ酸配列を検索配列として、本菌のゲノム配列に対してBLAST相同性検索を行った。その結果、7つの相同体を同定し、さらに、それらの中からDsbAの酵素活性に必須である活性配列(C-X-X-C)を保持しているか否かを調べたところ、6つのDsbA相同体を見いだした。申請者はそれらのDsbA相同体とDsbAとの整列配列比較およびPSI-PREDを用いた二次構造予測により2つのDsbA相同体(相同体AとB)に絞り、以下の解析を進めた。まず、病原株であるS.Typhimurium SL1344株の染色体よりPCR法を用いて、それぞれの相同体をコードする遺伝子をクローニングした。DNAシークエンスにより、フレームのシフトや終止コドンの挿入が無いことを確認し、発現ベクターにサブクローニングした後、大腸菌およびサルモネラ菌体内で発現することを確認した。次に、同定したDsbA相同体がDsbA酵素活性を保持するか否かを調べるために、DsbA依存性の3つの表現型:(1)鞭毛を介した運動、(2)外膜構造維持による還元剤に対する抵抗性、(3)一般的な基質として認識されているアルカリフォスファターゼの折り畳み、について、それぞれのDsbA相同体が関与するかを調べることにより評価した。大腸菌は1コピーのDsbAしか保持していないことから、大腸菌のDsbA変異株にそれぞれの発現ベクターを導入し、DsbA依存性の表現型が相補するか否かを調べた結果、相同体Aを発現するベクターを導入した大腸菌において、全ての表現型が回復した。これらの結果より、相同体Aは新規DsbAパラログであることが示唆された。現在、免疫沈降法およびLC-MS/MSを用いた手法による相同体Aの標的タンパク質の同定を試みている。

Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 strain DsbA sequence analysis and BLAST sequence analysis As a result, 7 of DsbA isoforms were identified, 7 of DsbA isoforms were identified, and 7 of DsbA isoforms were identified. The applicant shall submit the DsbA identity to the PSI-PRED secondary structure prediction, and the following analysis shall be carried out. A PCR method was used to detect S.Typhimurium SL1344, a pathogenic strain. DNA detection, detection, detection of Escherichia coli and detection of Escherichia coli in vivo DsbA-dependent phenotypes include:(1) flagellum mediated movement;(2) resistance to reduction in outer membrane structure maintenance; and (3) general substrate recognition. DsbA in E. coli remains unchanged, DsbA variants in E. coli are introduced, DsbA-dependent phenotypes complement each other, DsbA-dependent phenotypes are modified, DsbA variants are introduced, and complete phenotypes are restored. The result of this is that the same body A is the new DsbA. Now, the immunoprecipitation method and LC-MS/MS method are used to determine the identity of the same substance A.