脳機能のオプトジェネティクス研究へ向けた高汎用性ノックインマウスラインの確立

建立用于脑功能光遗传学研究的高度通用的敲入小鼠系

• 批准号: 22659051
• 负责人: 橋本 均
• 金额: $ 1.94万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22659051/
• 关键词: オプトジェネティクス; 神経細胞; マウスES細胞

遺伝子工学と光学を組合せて神経細胞を観察・制御するオプトジェネティクス研究が、脳神経回路の形成と動作原理を理解するうえで有効であるものと期待されている。このため、ミリ秒オーダーの高速に神経細胞を脱分極させる藻類の青色光感受性・陽イオンチャネル(channelrhodopsin-2,ChR2)が応用されている。そこで本研究ではCre-loxPシステムを用いて特定の脳領域・細胞種(特定のニューロンやグリアなど)にChR2を高発現できるノックインマウスの作製を目指している。そして、これが汎用性と精度が高く、脳研究に有用な遺伝子改変マウスであることを検証することを目標とする。2010年度の進捗状況と成果は、次に示す通りである。1)強力でユビキタスに働くプロモーターCAGを用いたChR2ターゲットノックインES細胞(マウスES細胞E14株)の相同組換え体について、DNA組換え酵素Creによる発現調節を、in vitroのレベルで確認した。2)上記(1)の解析によって、既に作成したコンストラクトでも、期待されるレベルの発現が得られる可能性が確認された。したがって、計画中の変異型のlox配列を用いた新たなターゲティングコンストラクトの作製よりも、現有クローンについての解析を先行し、変異マウスの発生をできるだけ前倒しして、実施することにした。3)ES細胞クローンのChR2の機能確認のため、未分化なES細胞クローン(ただしCre-loxP組換え体)、あるいは我々が作製したセロトニン神経細胞誘導法によって分化後の細胞について、蛍光タンパクVenusによる蛍光、電気生理学的解析、免疫染色法等による解析を実施した。

In the field of electronic engineering, optical components are used to investigate and control the formation and operation of neural circuits. The cyanine photosensitivity of algae (channelrhodopsin-2, ChR2) is used in the treatment of high speed neuronal depolarization. In this study, we developed a new method for the production of ChR2 in a specific domain and cell species. The purpose of this research is to improve the quality of the product. The progress and achievements of 2010 are shown in the following ways: 1)The expression regulation of the same component of ChR2 in ES cells (ES cell E14 strain) was confirmed in vitro. 2)The analysis of (1) above confirms the possibility of the occurrence of the expected event. In addition, the analysis of the existing database is carried out in advance, and the occurrence of different types of lox in the project is carried out in advance. 3) Functional confirmation of ChR2 in ES cells, analysis of undifferentiated ES cells (Cre-loxP group), control of ES cells, induction of neural cells, analysis of differentiated cells by fluorescence, electrophysiological analysis, immunostaining, etc.