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カニクイザル未成熟卵子の体外成熟培養法の確立

食蟹猴未成熟卵体外成熟培养方法的建立

基本信息

批准号：
23500495
负责人：
山崎樹里
金额：
$ 3.33万
依托单位：
Shiga University of Medical Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-23500495/
关键词：
発生工学体外成熟培養

项目摘要

当該年度は、卵巣刺激を施した成熟メスカニクイザルから採取された未成熟卵IF(germinal vesicle : GV、Metaphase I : MDを用いて、体外成熟培養法の確立、および体外成熟卵子の評価としての顕微授精を行った。体外成熟培養法の確立を目指し、TCM-199に10%-FBS、penicillin-strepmmycnを添加したものを基本培地とし、BDNF、GDNF、IGFI、EGF、RGF、Leptin、BstatiClの7因子添加の影響を調べた。また、ヒト可溶化羊膜(Human Solubilized Amnion products : HSAP)を培養器剤にコートして使用することで、ラミニン、ニドゲン、コラーゲンなどの影響を調べた。その結果、GV、MIどちらのステージにおいても、7因子の添加、およびHSAPの使用による体外成熟率の改善は見られなかった。また、体外成熟卵子の顕微授精の結果、高い受精率が得られた。しかし、体外培養により発生の確認を行った結果、全ての顕微受精胚が8細胞期～16細胞期で発生を停止した。そこで、体外成熟卵子の核成熟を確認するために、体外成熟卵子を固定、染色して核相を調べた結果、多くの卵子で核成熟が確認された。次に、体外成熟卵子の細胞質成熟を確認するために、ヒト卵子において、細胞質が成熟すると細胞質表面に整列する表層顆粒の分布を調べるために電子顕微鏡観察を行った。その結果、採卵時に成熟している卵子においても、表層顆粒が細胞質表面に整列しておらず、ヒトと同様の評価ができないことが確認された。また、体外成熟卵子の観察により、表層顆粒が細胞質表面に整列しているものが多数含まれていた。体外成熟卵子が顕微授精後に発生停止になることから、カニクイザルにおいて、表層顆粒が細胞質表面に整列していることは、細胞質成熟が過剰なのではないかと推察された。

In this year, when egg stimulation is applied to mature eggs, IF(germinal vesicle : GV, Metaphase I : MD) of immature eggs is adopted, in vitro maturation culture method is established, and in vitro maturation egg evaluation is carried out. The establishment of in vitro maturation method was indicated by the addition of TCM-199, 10%-FBS, penicillin-strepmycn, BDNF, GDNF, IGFI, EGF, RGF, Leptin and BstatiCl. Human Solubilized Amnion products (HSAP) are used to modulate the effects of culture conditions, such as temperature, humidity, and humidity. Results, GV, MI, in vitro maturation rate improvement, 7-factor addition, HSAP use The results of microinsemination of in vitro mature eggs and high fertilization rate were obtained. In vitro culture, the development of micro-fertilized embryos was confirmed and the development of micro-fertilized embryos was stopped from 8-cell stage to 16-cell stage. In vitro maturation egg nuclear maturation confirmation, in vitro maturation egg fixation, staining, nuclear phase modulation results, multiple egg nuclear maturation confirmation Secondly, to confirm the cytoplasmic maturation of in vitro matured eggs, to adjust the distribution of surface particles on the surface of the egg, the cytoplasm matures, and the cytoplasm is aligned on the surface of the cytoplasm, electronic microscopy was performed. The results, mature eggs at the time of egg collection, surface particles, cytoplasmic surface, and evaluation are confirmed. In vitro mature eggs are observed, surface particles are arranged on the surface of the cytoplasm, and most of them are contained. In vitro maturation of eggs after microinsemination is stopped, surface particles are arranged, cytoplasmic maturation is detected