新規低分子量G蛋白質のノックアウトマウス作出による生物時計機能の解明

地球上のほぼ全ての生物は、自身の体内に24時間周期の生物時計を持つ。この生物時計は、時計遺伝子の転写翻訳リズムによって生み出され、ホルモン分泌、血圧、体温、代謝のリズムを制御する。私は、生物時計の入出力に直接関わる分子として、生物時計の中枢である視交叉上核(SCN)に特異的に発現し、その発現に24時間の周期が見られる、機能未知の低分子量Gタンパク質GXを見出した。そこで私は、SCN特異的GXノックアウトマウスを作出し、GXの生物時計制御システムにおける機能の解明を試みる。またGXは、SCNのみならず全身の組織でも発現していることから、組織特異的GXノックアウトマウスを作出し、種々の病態の解明に生物時計の観点からアプローチする。全身性GXホモノックアウトマウス(GX-/-マウス)について、RI in situ hybridization法により、SCNにおけるGXのmRNA発現が消失していることを確認した、これにより、GX-/-マウスのSCNにおいて、GXが確かに欠失していることを確認できた。さらに、マウスを用いた実験で一般的に使われるC57BL/6近交系マウスと遺伝的背景を99.2%以上同一となったGX-/-マウスを作製した。このマウスについて同様に、行動リズムを明暗条件下、恒暗条件下で観察したところ、外界の明暗周期にうまく同調できないなどの明らかに異常な行動リズムが見られた。次に、GX-/-マウスの行動異常が、SCN内の生物時計異常が反映されたものか調べるために、Per1プロモーターでルシフェラーゼを発現させるPer1-lucマウスからSCNを取り出し、組織スライス培養系においてルシフェラーゼの発光を単細胞レベルで観察する手法を習得した。前年度の研究で得たGX-/-Per1-lucマウスから作成したSCNスライスで個々の細胞のPer1-luc発光リズムを観察したが、野生型との明確な違いは見られなかった。この単細胞レベルで生物時計を観察する手法を、時差などの明暗周期の大きな変化にすぐに同調できるバソプレッシン受容体VlaおよびVlbをダブルノックアウトした(V1DKO)マウスのSCNについて行った。タンパク質翻訳阻害剤CHXを投与し細胞リズムを一度リセットしたところ、V1DKOマウスではSCN細胞間に見られる背側から腹側へ向かう概日振動パターンが正常に回復しないことを見出した。

地球上のほぼ全ての生物は、自身の体内に24時間周期の生物時計を持つ。この生物時計は、時計遺伝子の転写翻訳リズムによって生み出され、ホルモン分泌、血圧、体温、代謝のリズムを制御する。私は、生物時計の入出力に直接関わる分子として、生物時計の中枢である視交叉上核(SCN)に特異的に発現し、その発現に24時間の周期が見られる、機能未知の低分子量Gタンパク質GXを見出した。そこで私は、SCN特異的GXノックアウトマウスを作出し、GXの生物時計制御システムにおける機能の解明を試みる。またGXは、SCNのみならず全身の組織でも発現していることから、組織特異的GXノックアウトマウスを作出し、種々の病態の解明に生物時計の観点からアプローチする。全身性GXホモノックアウトマウス(GX-/-マウス)について、RI in situ hybridization法により、SCNにおけるGXのmRNA発現が消失していることを確認した、これにより、GX-/-マウスのSCNにおいて、GXが確かに欠失していることを確認できた。さらに、マウスを用いた実験で一般的に使われるC57BL/6近交系マウスと遺伝的背景を99.2%以上同一となったGX-/-マウスを作製した。このマウスについて同様に、行動リズムを明暗条件下、恒暗条件下で観察したところ、外界の明暗周期にうまく同調できないなどの明らかに異常な行動リズムが見られた。次に、GX-/-マウスの行動異常が、SCN内の生物時計異常が反映されたものか調べるために、Per1プロモーターでルシフェラーゼを発現させるPer1-lucマウスからSCNを取り出し、組織スライス培養系においてルシフェラーゼの発光を単細胞レベルで観察する手法を習得した。前年度の研究で得たGX-/-Per1-lucマウスから作成したSCNスライスで個々の細胞のPer1-luc発光リズムを観察したが、野生型との明確な違いは見られなかった。この単細胞レベルで生物時計を観察する手法を、時差などの明暗周期の大きな変化にすぐに同調できるバソプレッシン受容体VlaおよびVlbをダブルノックアウトした(V1DKO)マウスのSCNについて行った。タンパク質翻訳阻害剤CHXを投与し細胞リズムを一度リセットしたところ、V1DKOマウスではSCN細胞間に見られる背側から腹側へ向かう概日振動パターンが正常に回復しないことを見出した。