細胞内mRNP動態解析によるmiRNA翻訳制御メカニズムの解明

通过细胞内 mRNA 动力学分析阐明 miRNA 翻译控制机制

• 批准号: 11J02706
• 负责人: 泉 奈津子
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J02706/
• 关键词: miRNA; mRNP

本研究は特定のmRNP (mRNA-タンパク質複合体)を細胞内から精製する手法を確立し、これを用いてmiRM結合によるmRNPの構成変化を解析することにより、miRNA作用機序を解明することを目的としてきた。mRNP精製技術を確立するため、これまでRNP精製タグやレポーターRNAの構造、精製条件など、種々の検討を重ねてきたが、細胞内からのレポーターmRNP回収効率が著しく低いという問題が解決できず、現状ではmRNP構成成分を解析することは困難であると判断した。このため、本年度は並行して進めてきたpiRNA経路の解析に注力した。piRNAは主に生殖系列細胞に発現する24-31塩基長のsmall RNAで、Argonauteファミリーに属するPIWIタンパク質と複合体を形成し、トランスポゾンの発現抑制に機能している。piRNA生成のメカニズムの詳細は未だ不明な点が多いが、長い1本鎖のpiRNA前駆体が、PIWIタンパク質に取り込まれた後、その3'末端が適切な長さまで削られ、2'-0-メチル化修飾を受けることで成熟piRNAがつくられると考えられている。昨年度から、piRNAを介したトランスポゾンの発現抑制への関与が示唆されていたHsp90シャペロンのpiRNA生成における役割を明らかにするために、Hsp90の活性阻害によるpiRNA経路への影響をin vivo、in vitroの両面から解析してきた。その結果、Hsp90がPIWIタンパク質を安定化し、piRNA前駆体のPIWIタンパク質への正しい取り込みを促進していることを明らかにした。また、本年度はPIWIタンパク質に取り込まれたpiRNA前駆体の3'末端のトリミングを担う未知のヌクレアーゼTrimmerの同定を目指した解析を進めた。Trimmerは細胞不溶性画分に存在し、その活性を可溶化することが困難なため、これまで生化学的に同定することができなかった。この問題を解決するため、様々な活性抽出条件の検討および最適化を行った結果、一部のトリミング活性を可溶化できる条件を見出すことに成功した。

In this study, we aimed to establish the method for intracellular purification of specific mRNP (mRNA-protein complex), and to elucidate the mechanism of miRNA action by analyzing the structural transformation of mRNP in combination with miRM. mRNP purification technology has been established, and it is difficult to determine the structure and purification conditions of mRNP purification and the recovery rate of mRNP in cells. This year, we are focusing on the analysis of RNA pathways. piRNA has the function of inhibiting the development of PIWI protein complexes, which are 24-31 bp long and belong to the genus Argonaute. The details of piRNA production are unclear. There are multiple middle and long middle locks of piRNA precursor, PIWI type, 3'terminal, appropriate length, 2'-0-chain modification, mature piRNA precursor, PIWI type, 3'terminal, 3' terminal, 3'terminal, In the past year, piRNA has been detected in vivo, in vitro and in vivo. As a result, Hsp90 was able to stabilize PIWI and piRNA precursors. This year, the PIWI was selected for the analysis of the 3'terminal region of the piRNA precursor. Trimmer has difficulty in determining the presence of cellular insoluble components and their activities. This problem was solved successfully by analyzing and optimizing the activity extraction conditions, and some of the activity extraction conditions were found successfully.

项目成果

Integrated regulation of PIKK-mediated stress responses by AAA+ proteins RUVBL1 and RUVBL2.

• DOI: 10.4161/nucl.18926
• 发表时间: 2012-01
• 期刊: Nucleus (Austin, Tex.)
• 作者: Izumi N;Yamashita A;Ohno S
• 通讯作者: Ohno S

Heat shock protein 90 regulates phosphatidylinositol 3-kinase-related protein kinase family proteins together with the RUVBL1/2 and Tel2-containing co-factor complex

• DOI: 10.1111/j.1349-7006.2011.02112.x
• 发表时间: 2012-01-01
• 期刊: CANCER SCIENCE
• 影响因子: 5.7
• 作者: Izumi, Natsuko;Yamashita, Akio;Ohno, Shigeo
• 通讯作者: Ohno, Shigeo

Hsp90 facilitates accurate loading of precursor piRNAs into PIWI proteins.

• DOI: 10.1261/rna.037200.112
• 发表时间: 2013-07
• 期刊: RNA (New York, N.Y.)
• 作者: Izumi N;Kawaoka S;Yasuhara S;Suzuki Y;Sugano S;Katsuma S;Tomari Y
• 通讯作者: Tomari Y

Recognition of the pre-miRNA structure by Drosophila Dicer-1

• DOI: 10.1038/nsmb.2125
• 发表时间: 2011-10-01
• 期刊: NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY
• 影响因子: 16.8
• 作者: Tsutsumi, Akihisa;Kawamata, Tomoko;Tomari, Yukihide
• 通讯作者: Tomari, Yukihide