特定の糖タンパク質視覚化を目指した蛍光プローブの開発と検出法の確立

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糖鎖修飾はタンパク質の主要な翻訳後修飾のひとつであり、様々な疾患で糖鎖構造の変化がタンパク質の機能変異を引き起こしている例が報告されている。しかし、糖鎖の機能解析は難しく、糖鎖構造の差異が特定のタンパク質の機能に及ぼす影響や病態との因果関係を明らかにすることは既存の方法では困難であるために、多くの分子機構は依然として不明である。そこで簡便かつ特異性の高い糖タンパク質イメージングツールを開発し、糖鎖が生体に及ぼす影響を生細胞において明らかにすることを目的とし、研究を行った。開発した手法は、目的のタンパク質に融合させた蛍光物質と、糖鎖に結合させた蛍光物質観でFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)を観察することで、特定の糖タンパク質における糖鎖付加状態の差異を明らかにするものである。本年度は、昨年度に引き続き、生細胞での特定の糖鎖をもつ標的タンパク質の細胞内動態解析を行った。HeLa細胞に、GFPを融合させたグルコーストランスポーターGLUT4を発現させ、シアル酸にタグを導入後、インスリンで刺激をしてGLUT4-GFPを細胞膜に集積させた。Alexa555で標識した生細胞用のクリックプローブを反応させた後、インスリンを除くことでエンドサイトーシスをスタートさせ、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。細胞膜非透過性の消光剤を用い、生細胞の表面の糖鎖を標識したラベル化剤が細胞内に入らないことを確認、観察されたFRETシグナルがGLUT4-GFPのエンドサイトーシスに因ることを示した。またシアル酸だけでなくフコース修飾された標的タンパク質の可視化にも成功した。