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Development of an extracellular messenger imaging method using silica nonwoven fabric and competitive FRET

使用二氧化硅无纺布和竞争性 FRET 开发细胞外信使成像方法

基本信息

批准号：
20K21686
负责人：
谷村明彦
金额：
$ 4.08万
依托单位：
Health Sciences University of Hokkaido
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-07-30 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、競合FRET法を利用した細胞外メッセンジャーのイメージング技術の確立のために生理活性物質と蛍光リガンドの競合を蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)による蛍光変化で測定することを原理とする「競合的蛍光リガンドアッセイ(CFLA)」と、抗原抗体反応を利用する「競合的蛍光抗原アッセイ(CFAA)」を使ったセンサーの開発と、それらを使ったin vivoイメージング法の確立である。今年度は①COOH基を付加したシリカ製不織布(COOH-不織布)の表面をBiotin-PEG11-Amineを用いて高密度ビオチン化し、avidinあるいはstreptavidinを結合させた高容量シリカ不織布担体を開発した。この高容量シリカ不織布担体に蛍光ペプチドを結合させた②テストセンサーをマウスの皮下に埋入し、共焦点レーザー・エンドスコープを使って可視化できることを確認した。この①実験に遅延があったため、蛍光ラベルしたアビジン・ビーズおよび蛍光ラベルした抗体を結合させたProtein Gビーズを使って、蛍光ラベルしたアビジンとビオチンの結合あるいは蛍光ラベルした抗BSA抗体とBSAの結合によるFRETシグナルの発生と競合物質によるFRETシグナルの低下から、③CFLA法およびCFAA法の基本原理を確認した。またこれらの方法を高容量シリカ不織布担体で実施するためのプロトコールを確立した。これらの原理を用いて実際のセンサーを作成するために、アンジオテンシンII受容体やEGF受容体と蛍光タンパク質（CFP）の融合タンパク質遺伝子や、それらの蛍光リガンドを作成した。さらに④Tetherd型センサーを開発するために、Protein G-SpyCatcher融合タンパク質遺伝子を作成し、このリコンビナント・タンパク質を大腸菌を使って発現させ、蛍光SpyTagペプチドの結合を確認した。

The purpose of this study is to establish a new technology for the detection of photoactive substances, photoactive substances, photoresonance, photoactive shift (FRET), photoactive shift (CFLA), and antigen-antibody reaction by using the competing FRET method. The law is established in vivo. This year, COOH-based coatings were added to the surface of COOH-nonwoven fabrics. Biotin-PEG11-Amine was used to develop high-density coatings, avidin, streptavidin, and high-capacity nonwovens. This high-capacity nonwoven support is visible in the form of a light source. This is the confirmation of the basic principle of CFLA method and CFAA method for the binding of anti-BSA antibody to BSA. The method of high-capacity nonwoven support is established. The principle of this paper is to use the real-time system to create a new system of receptor II, EGF receptor and CFP fusion system, and to create a new system of receptor II and CFP fusion system. In addition, the development of Tetherd-type protein catchers, the preparation of Protein G-SpyCatcher fusion proteins, the development of E. coli, and the identification of SpyTag fusion proteins.