Development of an extracellular messenger imaging method using silica nonwoven fabric and competitive FRET

使用二氧化硅无纺布和竞争性 FRET 开发细胞外信使成像方法

• 批准号: 20K21686
• 负责人: 谷村 明彦
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Health Sciences University of Hokkaido
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-07-30 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K21686/
• 关键词: 蛍光センサー; イメージング; 蛍光タンパク質; 蛍光リガンド; 抗原抗体反応; シリカ不織布; 細胞外メッセンジャー; 不織布; 蛍光共鳴エネルギー移動

本研究の目的は、競合FRET法を利用した細胞外メッセンジャーのイメージング技術の確立のために生理活性物質と蛍光リガンドの競合を蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)による蛍光変化で測定することを原理とする「競合的蛍光リガンドアッセイ(CFLA)」と、抗原抗体反応を利用する「競合的蛍光抗原アッセイ(CFAA)」を使ったセンサーの開発と、それらを使ったin vivoイメージング法の確立である。今年度は①COOH基を付加したシリカ製不織布(COOH-不織布)の表面をBiotin-PEG11-Amineを用いて高密度ビオチン化し、avidinあるいはstreptavidinを結合させた高容量シリカ不織布担体を開発した。この高容量シリカ不織布担体に蛍光ペプチドを結合させた②テストセンサーをマウスの皮下に埋入し、共焦点レーザー・エンドスコープを使って可視化できることを確認した。この①実験に遅延があったため、蛍光ラベルしたアビジン・ビーズおよび蛍光ラベルした抗体を結合させたProtein Gビーズを使って、蛍光ラベルしたアビジンとビオチンの結合あるいは蛍光ラベルした抗BSA抗体とBSAの結合によるFRETシグナルの発生と競合物質によるFRETシグナルの低下から、③CFLA法およびCFAA法の基本原理を確認した。またこれらの方法を高容量シリカ不織布担体で実施するためのプロトコールを確立した。これらの原理を用いて実際のセンサーを作成するために、アンジオテンシンII受容体やEGF受容体と蛍光タンパク質（CFP）の融合タンパク質遺伝子や、それらの蛍光リガンドを作成した。さらに④Tetherd型センサーを開発するために、Protein G-SpyCatcher融合タンパク質遺伝子を作成し、このリコンビナント・タンパク質を大腸菌を使って発現させ、蛍光SpyTagペプチドの結合を確認した。

は の purpose, this study co-opetition FRET を using し た extracellular メ ッ セ ン ジ ャ ー の イ メ ー ジ ン グ technology の establish の た め に physiological active substances と 蛍 light リ ガ ン ド の co-opetition を 蛍 resonance light エ ネ ル ギ ー mobile (FRET) に よ る 蛍 light - the determination of で す る こ と を principle と す る "co-opetition 蛍 light リ ガ ン ド ア ッ セ イ (CFLA) "と, antigen antibody against 応 を using す る" co-opetition 蛍 light antigen ア ッ セ イ (CFAA) "を make っ た セ ン サ ー の open 発 と, そ れ ら を make っ た in vivo イ メ ー ジ ン の グ method established で あ る. Our は "(1) COOH base pay plus し を た シ リ カ nonwoven (COOH) system of nonwoven fabric surface を の Biotin - PEG11 - Amine を with い て high-density ビ オ チ ン し, avidin あ る い は streptavidin を combining さ せ た high-capacity シ リ nonwoven カ supporter を open 発 し た. Nonwoven こ の high-capacity シ リ カ supporter に 蛍 light ペ プ チ ド を combining さ せ た (2) テ ス ト セ ン サ ー を マ ウ ス の subcutaneous に embedment し, total focus レ ー ザ ー · エ ン ド ス コ ー プ を make っ て visualization で き る こ と を confirm し た. こ の (1) be 験 に 遅 delay が あ っ た た め 蛍 light ラ ベ ル し た ア ビ ジ ン · ビ ー ズ お よ び 蛍 light ラ ベ ル し を た antibody combining さ せ た Protein G ビ ー ズ を make っ て 蛍 light ラ ベ ル し た ア ビ ジ ン と ビ オ チ ン の combining あ る い は 蛍 light ラ ベ ル し た anti BSA antibody と BSA の combining に よ る FRET シ グ ナ ル の 発 raw material に と phenomenon in よ る FRET シ グ ナ ル の low か ら, (3) CFLA お よ び principle の CFAA を confirm し た. ま た こ れ ら の way を high-capacity シ リ nonwoven カ supporter で す be applied る た め の プ ロ ト コ ー ル を establish し た. Principle of こ れ ら の を using い て be interstate の セ ン サ ー を made す る た め に, ア ン ジ オ テ ン シ ン II by let body や EGF is let body と 蛍 light タ ン パ ク mass (CFP) の fusion タ ン パ ク qualitative heritage 伝 や, そ れ ら の 蛍 light リ ガ ン ド を made し た. さ ら に type (4) Tetherd セ ン サ ー を open 発 す る た め に, fusion Protein G - SpyCatcher タ ン パ ク qualitative heritage 伝 を し consummate, こ の リ コ ン ビ ナ ン ト · タ ン パ ク qualitative を coliform を make っ て 発 now さ せ 蛍 light SpyTag ペ プ チ ド の combining を confirm し た.