Development of an extracellular messenger imaging method using silica nonwoven fabric and competitive FRET

使用二氧化硅无纺布和竞争性 FRET 开发细胞外信使成像方法

基本信息

批准号：
20K21686
负责人：
谷村明彦
金额：
$ 4.08万
依托单位：
Health Sciences University of Hokkaido
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-07-30 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、競合FRET法を利用した細胞外メッセンジャーのイメージング技術の確立のために生理活性物質と蛍光リガンドの競合を蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)による蛍光変化で測定することを原理とする「競合的蛍光リガンドアッセイ(CFLA)」と、抗原抗体反応を利用する「競合的蛍光抗原アッセイ(CFAA)」を使ったセンサーの開発と、それらを使ったin vivoイメージング法の確立である。今年度は①COOH基を付加したシリカ製不織布(COOH-不織布)の表面をBiotin-PEG11-Amineを用いて高密度ビオチン化し、avidinあるいはstreptavidinを結合させた高容量シリカ不織布担体を開発した。この高容量シリカ不織布担体に蛍光ペプチドを結合させた②テストセンサーをマウスの皮下に埋入し、共焦点レーザー・エンドスコープを使って可視化できることを確認した。この①実験に遅延があったため、蛍光ラベルしたアビジン・ビーズおよび蛍光ラベルした抗体を結合させたProtein Gビーズを使って、蛍光ラベルしたアビジンとビオチンの結合あるいは蛍光ラベルした抗BSA抗体とBSAの結合によるFRETシグナルの発生と競合物質によるFRETシグナルの低下から、③CFLA法およびCFAA法の基本原理を確認した。またこれらの方法を高容量シリカ不織布担体で実施するためのプロトコールを確立した。これらの原理を用いて実際のセンサーを作成するために、アンジオテンシンII受容体やEGF受容体と蛍光タンパク質（CFP）の融合タンパク質遺伝子や、それらの蛍光リガンドを作成した。さらに④Tetherd型センサーを開発するために、Protein G-SpyCatcher融合タンパク質遺伝子を作成し、このリコンビナント・タンパク質を大腸菌を使って発現させ、蛍光SpyTagペプチドの結合を確認した。

The purpose of this study was to develop a sensor using the "Competitive Fluorescent Ligand Assay (CFLA)," which uses the principle of measuring the competition between physiologically active substances and fluorescent ligands by fluorescence change due to fluorescence resonance energy transfer (FRET), and the "Competitive Fluorescent Antigen Assay (CFAA)," which utilizes antigen-antibody reactions, and to establish an in使用这些方法的体内成像方法。今年，1）我们已经开发了一种高容量的二氧化硅非织造织物（COOH-NONWOVEN织物），其中使用二氧化硅非织造织物（COOH-NONWOVEN织物）用COOH组添加了高密度的生物素化，并使用生物素 - 氨基氨基氨基胺，和抗蛋白链蛋白蛋白质或链霉亲素结合了高密度生物素化。该测试传感器与这种高容量的二氧化硅非式载体结合，植入了小鼠的皮肤下，并确认可以使用共聚焦激光内窥镜进行可视化。由于该实验的延迟，使用荧光标记的Avidin珠和蛋白质G珠确认了CFLA和CFAA方法的基本原理，并与荧光标记为抗生物素和生物素的荧光标记，或与BSA的抗抗BSA抗体的荧光结合，以及与Frets Simpals竞争的BSA抗体，以及与BSA竞争的竞争。还建立了一项方案，用于在高容量的二氧化硅非织造支持上执行这些方法。为了使用这些原理创建实际传感器，我们创建了血管紧张素II受体EGF受体和荧光蛋白（CFP）的融合蛋白基因，并为这些受体创建了荧光配体。此外，为了开发蛋白质型传感器，创建了一种蛋白质G-SpyCatcher融合蛋白基因，并使用大肠杆菌表达了这种重组蛋白，并确认了荧光间谍肽的结合。