Development of an extracellular messenger imaging method using silica nonwoven fabric and competitive FRET

使用二氧化硅无纺布和竞争性 FRET 开发细胞外信使成像方法

• 批准号: 20K21686
• 负责人: 谷村 明彦
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Health Sciences University of Hokkaido
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-07-30 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K21686/
• 关键词: 蛍光センサー; イメージング; 蛍光タンパク質; 蛍光リガンド; 抗原抗体反応; シリカ不織布; 細胞外メッセンジャー; 不織布; 蛍光共鳴エネルギー移動

本研究の目的は、競合FRET法を利用した細胞外メッセンジャーのイメージング技術の確立のために生理活性物質と蛍光リガンドの競合を蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)による蛍光変化で測定することを原理とする「競合的蛍光リガンドアッセイ(CFLA)」と、抗原抗体反応を利用する「競合的蛍光抗原アッセイ(CFAA)」を使ったセンサーの開発と、それらを使ったin vivoイメージング法の確立である。今年度は①COOH基を付加したシリカ製不織布(COOH-不織布)の表面をBiotin-PEG11-Amineを用いて高密度ビオチン化し、avidinあるいはstreptavidinを結合させた高容量シリカ不織布担体を開発した。この高容量シリカ不織布担体に蛍光ペプチドを結合させた②テストセンサーをマウスの皮下に埋入し、共焦点レーザー・エンドスコープを使って可視化できることを確認した。この①実験に遅延があったため、蛍光ラベルしたアビジン・ビーズおよび蛍光ラベルした抗体を結合させたProtein Gビーズを使って、蛍光ラベルしたアビジンとビオチンの結合あるいは蛍光ラベルした抗BSA抗体とBSAの結合によるFRETシグナルの発生と競合物質によるFRETシグナルの低下から、③CFLA法およびCFAA法の基本原理を確認した。またこれらの方法を高容量シリカ不織布担体で実施するためのプロトコールを確立した。これらの原理を用いて実際のセンサーを作成するために、アンジオテンシンII受容体やEGF受容体と蛍光タンパク質（CFP）の融合タンパク質遺伝子や、それらの蛍光リガンドを作成した。さらに④Tetherd型センサーを開発するために、Protein G-SpyCatcher融合タンパク質遺伝子を作成し、このリコンビナント・タンパク質を大腸菌を使って発現させ、蛍光SpyTagペプチドの結合を確認した。

The purpose of this study is to determine the physiological activity of photoluminescence by using the FRET method. The principle of photoluminescence was used to determine the principle of photosensitizer, photosensitizer, photoluminescence, photoluminescence, The antigen-antibody reaction uses the conjugated photoluminescent antigen immunoassay (CFAA) to make the system open, and the antibody to make sure that the in vivo method is established. This year, the 1COOH system is used to increase the quality of the cloth (COOH- cloth). The surface of the Biotin-PEG11-Amine is used for high-density production, and the avidin system is used in combination with the high-capacity cloth carrier. In order to improve the performance of the high-capacity equipment, the optical system is used in combination with the device. The device is embedded under the skin and has a common focus. This makes it possible to make sure that the device is validated. The combination of anti-BSA antibodies, anti-DNA antibodies, anti-BSA antibodies, anti-DNA antibodies, anti-DNA antibodies, The 3CFLA method confirms the basic principles of the CFAA method. In this way, the high-capacity cloth carrier is applied to ensure the safety of the carrier. The principle of this paper is based on the principle of II capacitors, EGF capacitors, light sensors (CFP), fusion devices, light sensors, light sensors. For example, 4Tetherd type of equipment, the fusion of Protein G-SpyCatcher and SpyTag, the detection of bacteria, the detection of bacteria, the detection of bacteria and the combination of photoluminescence and photoluminescence were used to make sure that it was confirmed.