プロテアソーム活性化因子の分子集合機構の解明

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本研究では、プロテアソームの分子集合機構を時空間的に理解することを最終目標としている。既知のプロテアソーム特異的シャペロンはプロテアソーム中間体に一過的に結合する性質であるため、1年目である今年度はプロテアソームの一過性結合因子の同定を試みた。ネイティブ質量分析法により出芽酵母26Sプロテアソームの構成量比と中間体の解析を行ったところ、19S制御因子複合体の基底部を構成するサブユニットRpn1を含むプロテアソーム中間体より脱ユビキチン化酵素Ubp6が新たに同定された。確認のため、アフィニティー精製したプロテアソームをショ糖密度勾配遠心法により分画しウェスタンブロット解析したこところ、プロテアソーム中間体を含むフラクションにUbp6が同定された。Ubp6がプロテアソームの分子集合に関与しているか検討するため、既知のプロテアソーム特異的シャペロンとの多重変異株を作製した。温度感受性を試験したところ、多重変異株において高温で相加的な成長遅延が見られたためUBP6はプロテアソームの分子集合を正に制御している可能性が示唆された。ネイティブ電気泳動-in gel蛍光イメージングで複合体形成能を解析したところ、多重変異株において26Sプロテアソームおよびプロテアソーム中間体の形成が顕著に低下していた。これらの結果から、Ubp6がプロテアソーム中間体に結合することにより非特異的に結合するユビキチン化タンパク質を排除するという仮説を立てた。UBP6の欠損株からプロテアソームを精製し、ショ糖密度勾配遠心-ウェスタンブロット解析したところプロテアソーム中間体を含むフラクションにユビキチン化タンパク質の蓄積が見られた。リコンビナントのUbp6を加えてインキュベートしたところ、ユビキチン化基質の蓄積は解消された。プロテアソームの分子集合にUbp6の活性が必要なのかを検討するため、変異体であるubp6 C118Aを多重変異株に戻したところ温度感受性を抑制することが出来なかった。これらからUbp6がプロテアソーム中間体に結合し、活性依存的にユビキチン化基質の結合を排除することでプロテアソームの分子集合を保護するという新たな機構が明らかとなった。