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プロテアソーム活性化因子の分子集合機構の解明

阐明蛋白酶体激活剂的分子组装机制

基本信息

批准号：
11J06251
负责人：
福永圭佑
金额：
$ 0.51万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J06251/
关键词：
プロテアソーム複合体質量分析出芽酵母

项目摘要

本研究では、プロテアソームの分子集合機構を時空間的に理解することを最終目標としている。既知のプロテアソーム特異的シャペロンはプロテアソーム中間体に一過的に結合する性質であるため、1年目である今年度はプロテアソームの一過性結合因子の同定を試みた。ネイティブ質量分析法により出芽酵母26Sプロテアソームの構成量比と中間体の解析を行ったところ、19S制御因子複合体の基底部を構成するサブユニットRpn1を含むプロテアソーム中間体より脱ユビキチン化酵素Ubp6が新たに同定された。確認のため、アフィニティー精製したプロテアソームをショ糖密度勾配遠心法により分画しウェスタンブロット解析したこところ、プロテアソーム中間体を含むフラクションにUbp6が同定された。Ubp6がプロテアソームの分子集合に関与しているか検討するため、既知のプロテアソーム特異的シャペロンとの多重変異株を作製した。温度感受性を試験したところ、多重変異株において高温で相加的な成長遅延が見られたためUBP6はプロテアソームの分子集合を正に制御している可能性が示唆された。ネイティブ電気泳動-in gel蛍光イメージングで複合体形成能を解析したところ、多重変異株において26Sプロテアソームおよびプロテアソーム中間体の形成が顕著に低下していた。これらの結果から、Ubp6がプロテアソーム中間体に結合することにより非特異的に結合するユビキチン化タンパク質を排除するという仮説を立てた。UBP6の欠損株からプロテアソームを精製し、ショ糖密度勾配遠心-ウェスタンブロット解析したところプロテアソーム中間体を含むフラクションにユビキチン化タンパク質の蓄積が見られた。リコンビナントのUbp6を加えてインキュベートしたところ、ユビキチン化基質の蓄積は解消された。プロテアソームの分子集合にUbp6の活性が必要なのかを検討するため、変異体であるubp6 C118Aを多重変異株に戻したところ温度感受性を抑制することが出来なかった。これらからUbp6がプロテアソーム中間体に結合し、活性依存的にユビキチン化基質の結合を排除することでプロテアソームの分子集合を保護するという新たな機構が明らかとなった。

The ultimate goal of this study is to understand the time and space of molecular aggregation mechanisms. It is known that the specific binding properties of the intermediate are determined by the transient binding factor of the intermediate. The composition of budding yeast 26S protein was determined by mass spectrometry. The composition of budding yeast 26S protein was determined by mass spectrometry. The composition of budding yeast 19S protein was determined by mass spectrometry. To confirm the identity of Ubp 6 in the intermediate, the purification of Ubp6 in the intermediate was carried out. Ubp6 is a molecular collection of known and unique species. Temperature sensitivity test, multiple heterosis test, high temperature test, growth delay test, UBP6 test, molecular aggregation test, positive control test, etc. The formation of complex can be resolved by electrophoresis in gel, and the formation of intermediate can be reduced by multiple heterozygotes. The result is that Ubp6 can bind to any intermediate without specific binding. UBP6 is a defective strain, and its sugar density is matched with that of a remote center. The Ubp6 of the file is added to the file. The activity of Ubp6 is essential for the development of molecular systems. The activity of Ubp6 C118A is essential for the development of molecular systems. The activity of Ubp6 C118A is essential for the development of molecular systems. Ubp6 is a new mechanism for binding, activity-dependent binding, and protection of molecular aggregates.