Local elektrochemical detection of the hybridisation of complementary oligonucleotides on micro-structured surfaces

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Neben der Reproduzierbarkeit der Herstellung und der weiteren Miniaturisierung kommt bei der Entwicklung von DNA-Chips der Detektion der lokalen Hybridisierung von Fragmenten oberflächengebundener einsträngiger Sonden-DNA mit Target-DNA aus der Probe die entscheidende technologische Bedeutung zu. Im Rahmen dieses Projektes soll ein neues, elektrochemisches Ausleseverfahren für Hybridisierungsereignisse auf DNA-Chips entwickelt werden. Im Gegensatz zu bislang beschriebenen optischen und elektrochemischen Methoden soll die Detektion ohne Markierung der Sonden- oder Target-DNA erfolgen. Die labelfreie Detektionsmethode basiert auf der Modulation der Elektronentransferkinetik einer negativ geladenen Redoxspezies an einer Basiselektrode infolge von Abstoßungskräften gegenüber negativen Ladungen von Phosphatgruppe im Rückgrat der auf der Chipoberfläche fixierten DNA-Stränge. Fernziel des Projektes ist es, Hybridisierungsreaktionen in-situ und mit hoher Ortsauflösung auf dem Chip zu verfolgen, Missmatches aufzuklären und parallel mittels oberflächengebundener Oligonukleotidbibliotheken-Proben hinsichtlich der Präsenz spezifischer DNA-Sequenzen mit hoher Sensitivität zu untersuchen. Dazu müssen einzelsträngige DNA-Fragmente in kontrollierter Weise über die Wahl einer geeigneten Bindungschemie kovalent an mit selbstorganisierenden Thiol-Monoschichten modifizierten Goldoberflächen angebunden werden, wobei unspezifische Adsorption minimiert oder der Einfluss der Oberflächenkonzentration der Oligonukleotide evaluiert werden sollen. Die mikrostrukturierte Deposition verschiedener Oligonukleotide soll durch Piezodispensing, Mikrospotting oder auch durch die Verwendung der elektrochemischen Nahfeldmikroskopie erfolgen. Die Modulation der Regeneration einer Redoxspezies an der Basiselektrode soll mittels hochauflösender elektrochemischer Rastermikroskopie (SECM) überprüft und visualisiert werden. Eine langsame in-situ-Temperaturerhöhung bis zum Schmelzpunkt der gebildeten DNA-Doppelstränge unter simultanen Beobachtung der modifizierten Oberflächenbereiche mittels SECM soll letztlich zur Detektion von Missmatches und von Single-Nukleotid-Polymorphism (SNP) herangezogen werden.