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ヒトiPS/ES細胞を用いた高感度発達神経毒性試験

使用人类 iPS/ES 细胞进行高灵敏度发育神经毒性测试

基本信息

批准号：
12F02416
负责人：
大迫誠一郎
金额：
$ 1.54万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2014
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12F02416/
关键词：
ES細胞 iPS細胞毒性評価ヒト

项目摘要

神経系細胞マーカーとしてチロシンハイドロキシラーゼ(TH)、肝細胞マーカーとしてアルブミン(ALB)遺伝子のプロモーターにEGFPを連結させたプラスミドをヒトES細胞に遺伝子導入し、ヒト多能性幹細胞試験の構築に向けた作業の一部を実施した。まずヒトのTHとALBプロモーター配列をロングPCRで増幅し、EGFPをもつプラスミドの上流にクローニング、DNAを適宜切り出し、Neomycin耐性遺伝子をもつプラスミドpIRESNeoベクターに連結させてコンストラクトを作成した。作成したMouse ALB-EGFP, Human ALB-EGFP, Rat TH-EGFP, Human TH-EGFPをLipofectamine 2000によるリポフェクションでヒトレチノブラストーマ細胞(SK-N-SH)、ヒト肝がん細胞(HepG2)、ラットPC12細胞、マウス肝がん細胞(Hepa1c1c7)へ遺伝子導入し、プロモーター活性の種特異性を検討した。上記コンストラクトをLipofectamine LTXでヒトES細胞(KhES1)へ遺伝子導入しG418によるセレクションを実施、生存した細胞はラットTH遺伝子を連結したRat-TH-EGFP(KhES1-rTHEGFP)のみであった。この細胞をクローン化し、神経系細胞分化培養に持ち込んだところEGFP陽性の突起を持った細胞が少数であるが発生した。樹立したヒトES細胞株でダイオキシン(TCDD)の曝露実験を実施し、TH陽性細胞の出現率を指標に神経系発達毒性を検討した。TH陽性細胞の出現率の増加傾向を認めた。発生数が少なかったため定量的解析は出来なかった。一方、平行して実施した野生型ヒトES細胞の分化実験でも、TCDDによるTH陽性細胞の有意な増加が認められた。

The construction of pluripotent stem cell assays was carried out as part of the EGFP linkage process for the introduction of genes into ES cells and the construction of pluripotent stem cell assays. The PCR amplification of TH and ALB gene sequences, EGFP gene sequences, DNA gene sequences, Neomycin resistant gene sequences, pIRESNeo gene sequences and DNA sequences were determined. Mouse ALB-EGFP, Human ALB-EGFP, Rat TH-EGFP, Human TH-EGFP, Lipofectamine 2000, SK-N-SH, HepG2, HepA1c1c7, HepG2, HepG3, HepG2, HepG3, HepG3, HepG4, Hep Note that Lipofectamine LTX can be introduced into ES cells (KhES1) to facilitate the implementation and survival of RAT-TH-EGFP(KhES1-rTHEGFP). The cell differentiation culture of this kind of cells was carried out in a small number of EGFP positive cells. To establish a new ES cell line, TCDD was used as an indicator of the occurrence of TH-positive cells and the toxicity of the nervous system. The occurrence rate of TH positive cells tended to increase. The number of births is less than the number of quantitative analysis. The differentiation of wild-type ES cells and the intentional increase of TH-positive cells in TCDD cells were observed in parallel.