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肝発生環境を模倣したヒトｉＰＳ細胞からの肝分化誘導システムの開発とその応用

模拟肝脏发育环境的人iPS细胞诱导肝脏分化系统的研制及其应用

基本信息

批准号：
12J03334
负责人：
樋口麻衣子
金额：
$ 2.53万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J03334/
关键词：
ヒトiPS細胞肝細胞分化誘導法三次元培養

项目摘要

ヒト人工多能性肝細胞(iPS細胞)は、肝細胞等のあらゆる細胞に分化することから、再生医療への応用や、薬物のin vitro毒性スクリーニング系に応用することが期待されている。ヒトiPS細胞から高効率かつ高機能な成熟肝細胞を分化誘導可能な方法を確立するために、生体内肝臓環境をin vitroで模倣した分化培養系の構築、具体的には、肝発生時に隣接している細胞および肝組織構成細胞との共培養が可能な三次元分化培養系の確立を目指し、研究を遂行した。三次元培養法が種々存在する中で、共培養細胞とiPS細胞由来分化誘導細胞との隣接面積が高く、且つ細胞と足場素材との相互作用を極力無視できるといった点から集積培養法に着目した。この方法は、細胞1個1個の表面にフィブロネクチン―ゼラチン薄膜を形成させることにより、細胞間の接着足場を提供し、細胞を垂直方向に積層化できる三次元培養法である。三次元培養下でiPS細胞由来肝細胞の成熟化を行った際に、平面培養条件と比べて肝機能が向上するかを調べた。iPS細胞から肝幹/前駆細胞を分化誘導後、細胞を剥離し、細胞へ薄膜コーティングを行った。これら細胞をセルインサートに播種することで、三次元体を形成させた後、肝細胞成熟化培養条件下で培養を行った。その結果、単層で成熟化した系に比べ、薬物代謝酵素遺伝子の発現量が上昇した。その中でも特に、CYP2D6, CYP2C9, CYP1A1, CYP1A2の発現が5～15倍上昇した。さらに、体細胞からips細胞を経ず、直接的に肝細胞への分化誘導可能な手法の開発についても検討を行った。肝幹/前駆細胞のマーカーであるα-フェトプロテインプロモーターの下流にGFPを搭載したトランスジェニックマウスを入手し、このマウスの胎児繊維芽細胞(Afp-GFPMEF)を用いて直接的分化誘導実験を行った。Afp-GFPMEFに初期化リプログラミング遺伝子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)を遺伝子導入し、partially-reprogrammingを起こし、そこから肝分化培養条件下で培養すると、約2週間後にGFPの蛍光を示す細胞が出現した。GFP陽性細胞をソーティングし、遺伝子発現を調べたところ肝幹前駆細胞様細胞が分化誘導できたことが分かった。

Artificial pluripotent liver cells (iPS cells), liver cells, etc., differentiation of cells, regenerative medicine, toxicity of in vitro, toxicity of hepatocytes and so on. The high frequency of iPS cell culture can induce mature liver cell differentiation. It is possible to ensure the establishment of liver cell differentiation cycle, in vivo liver environment in vitro model differentiation culture system, specific liver tissue culture, liver cell culture, cell cycle co-culture and triple differentiation culture. Three times of metaculture methods exist in medium and co-cultured cells. The origin of cell differentiation leads to the high interface of iPS cells, and the interaction of materials is independent of the effect of cell culture. The method and the cell are used to form a thin film with a surface temperature of one and a half, the cell is connected to the field to provide the cell, and the cell is vertically active in the cell culture method. Under the condition of three-dimensional culture, the iPS cells were matured from the liver cells, and the condition of plane culture was better than that of the liver machine. After the differentiation of iPS cells, the cells were dissected, and the membrane of cells was isolated. After the formation of triplet cells and the maturation of liver cells, the cells were cultured under the condition of mature liver cells. The results of the experiment, the comparison of the mature enzyme and the content of the enzyme were measured. The price of CYP2D6, CYP2C9, CYP1A1, CYP1A2 is 5% and 15 times higher than that of others. Cell culture, somatic cell culture, ips cell differentiation and direct differentiation of liver cells may be carried out by means of manipulation. The liver