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多色１分子イメージングによるＴ細胞活性化シグナル分子の時空間的な相互作用の解明

使用多色单分子成像阐明 T 细胞激活信号分子的时空相互作用

基本信息

批准号：
12J08832
负责人：
伊藤由馬
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、研究計画に従い、多色同時1分子観察画像の解析を継続して行った。特に昨年度において確立した蛍光1分子の軌跡解析手法を発展させ、それを3色同時撮影したT細胞表面の蛍光1分子動画に適用し、CD3-EGFPで標識された微小なマイクロクラスター内におけるTCRの1分子動態を定量解析した。その結果、クラスター内のTCRには少なくとも2種類の拡散状態が存在することを明らかにした。また、TCRとは相互作用しない膜タンパク質CD45においても、マイクロクラスター内では複数の拡散成分が得られたことから、これらの拡散の異なる環境はタンパク質の種類に依存しない可能性を示すことができた。さらに、本研究で用いた脂質二重膜構築法の改良を行った。従来法は煩雑なガラス表面洗浄処理や専用装置が必要であるため、生細胞観察への適用に困難が伴い、利用が限られていた。そこで1分子観察に使われる洗浄方法を脂質二重膜の構築に適用し、均一な膜を再現性高く簡便に構築できる方法を確立した。特に洗浄過程で基板にダメージを与えないため、ガラスボトムディッシュ等の使用が可能になり、広範な細胞生物学の研究に利用することが可能になった。さらに、簡便に構築した脂質二重膜に対して、光褪色後蛍光回復（FRAP）法による観察を行い、数値シミュレーションにより拡散係数を見積もったところ、脂質二重膜は細胞表面より十分高い流動性を保持していることが確認できた。また、脂質二重膜上におけるT細胞表面マイクロクラスターの経時変化の観察から、細胞表面分子の流動性も維持されることを確認した。以上は生細胞や光学顕微鏡に限らず、１分子解析やin vitroでの表面分子の分析など、広汎に脂質二重膜を利用することが可能な方法であり、論文として報告した（Ito et al., 2014, Analytical Sciences）。

This year's research project includes analysis of multi-color simultaneous 1-molecule observation images. The special method of analyzing the trajectory of a single molecule of light established last year is a three-color simultaneous imaging of the movement of a single molecule of light on the surface of T cells. The drawing is applicable to the identification of CD3-EGFP and the quantitative analysis of the molecular dynamics of TCR in the micro-structure.そのRESULTS, クラスター内のTCRには小なくとも2 kinds of の拡 scattered state がexistent することを明らかにした.また, TCR とは interaction membrane タンパク CD45 においても, マイクロクラスター内では plural の拡 dispersed ingredientsが得られたことから、これらの拡SanのdifferentなるEnvironmentはタンパクqualityのkindにdependenceしないpossibilityをshowすことができた. This study used a modified method of constructing a lipid double membrane by Toshiko. The method for surface cleaning treatment is that it is necessary to use only the equipment, the cell inspection is difficult to apply, and the utilization is not limited. The 1-molecule observation and cleaning method is applicable to the construction of lipid double membranes, and the uniform membrane has high reproducibility and simplicity, and the construction method has been established. The special cleaning process is for substrate cleaning, cleaning, cleaning, cleaning, etc. It is possible to use it, and it is possible to use it for cell biology research.さらに、Easy construction of lipid double membrane に対して、Photorecovery after light fading (FRAP) method による観Observationを行い、Number of measurements シミュレーシThe ョンにより拡 coefficient をSee accumulation もったところ, lipid double membrane は cell surface より very high fluidity を maintenance していることが confirmation できた.また, lipid double membrane on the T cell surface マイクロクラスターの経time change の禳看から, the fluidity of the cell surface molecules is maintained されることをconfirmation した. The above-mentioned biological cells are limited to optical microscopy and 1-molecule analysis. Analysis of surface molecules in vitro, Possible method of using lipid double membrane, and report of paper (Ito et al., 2014, Analytical Sciences).