シグナル伝達の場としてのサブオルガネラ脂質ドメインの可視化と機能的意義の解明

亚细胞器脂质结构域作为信号转导位点的可视化及其功能意义的阐明

• 批准号: 12J10940
• 负责人: 高鳥 翔
• 金额: $ 2.32万
• 依托单位: The University of Tokyo (2014)Nagoya University (2012-2013)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J10940/
• 关键词: 急速凍結; 凍結割断レプリカ標識法; 脂質ドメイン; 脂質ラフト; ホスホイノシチド; 出芽酵母; 液胞; エンドソーム; シグナル伝達; 細胞内オルガネラ

膜分子がサブオルガネラのレベルで偏りをもって分布し機能的なドメインを形成しているとの仮説が広く受け入れられている。しかし個々の膜脂質の膜内分布を詳細に明らかにした例は限られている。そこで、膜脂質の分布解析に優れた急速凍結・凍結割断レプリカ標識法を応用して形態学的に膜ドメインの実証を目指した。本研究の開始時点で、ホスファチジルイノシトール(3,5)二リン酸（PI(3,5)P2）の詳細な細胞内分布は知られていなかった。しかし、PI(3)PとPI(3,5)P2に結合するATG18タンパク質をプローブとし、さらにPI(3)P特異的な結合能を示すp40phox PXドメインタンパク質を用いてPI(3)P結合性のみを競合的に阻害することにより、PI(3,5)P2特異的な標識が可能になった。次に、PI(3,5)P2発現量を増加させる高張液処理を施した出芽酵母にこの手法を適用した。PI(3,5)P2の標識は液胞膜に特異的に認められ、細胞由来サンプルにおいても本手法の有効性が示された。興味深いことに、高張液処理した液胞膜には膜タンパク質が排除された膜ドメインが認められ、PI(3,5)P2の標識はこの領域に集中していた。さらに哺乳類細胞においてPI(3,5)P2の細胞内分布を検索したところ、標識はエンドソーム様の細胞内小胞に限局していた。この小胞は特徴的な細管状の突起構造を有しており、後期エンドソームのマーカーであるRAB7陽性であった。詳細に観察すると、PI(3,5)P2の標識はこの突起部からは排除される傾向にあり、小胞部分において集中していた。以上の結果から、PI(3,5)P2が種差を超えてドメイン状の分布をとることが初めて明らかになった。本研究を通じて、後期エンドソーム・リソソームにおいてPI(3,5)P2に富む新たな機能的ドメインが存在する可能性が示唆される。

Membrane molecular が サ ブ オ ル ガ ネ ラ の レ ベ ル で partial り を も っ て distribution function of し な ド メ イ ン を form し て い る と の 仮 said が hiroo く by け into れ ら れ て い る. <s:1> 々 <s:1> membrane lipids <e:1> intramembrane distribution を detailed に picture ら に に た た example られて limit られて る る る る る そ こ で, membrane lipid の analytical に optimal distribution れ た quick freezing, frozen cut レ プ リ カ identification method を 応 with し て morphology に membrane ド メ イ ン の card be を refers し た. This study の start point で, ホ ス フ ァ チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル (3, 5) 2 リ ン acid (PI (3, 5) P2) の detailed な intracellular distribution は know ら れ て い な か っ た. し か し, PI (3) P と PI (3, 5) P2 に す る ATG18 タ ン パ ク qualitative を プ ロ ー ブ と し, さ ら に PI (3) P specific な binding energy を shown す p40phox PX ド メ イ ン タ ン パ ク qualitative を with い て PI (3) P associativity の み を co-opetition に resistance against す る こ と に よ り, PI (3, 5) P2 specific な logo が may に な っ た. The subsequent に, the increase of the occurrence amount of PI(3,5)P2 を, the treatment of させる hypertonic fluid を, the application of <s:1> た germinating yeast に the <s:1> technique を is applicable to た た. PI (3, 5) P2 の logo は vacuole membrane に specific に recognize め ら れ, cell origin サ ン プ ル に お い て も this gimmick の have sharper sex が shown さ れ た. Takes deep い こ と に, high liquid 処 し た vacuole membrane に は membrane タ ン パ ク qualitative が exclude さ れ た membrane ド メ イ ン が recognize め ら れ, PI (3, 5) P2 の identification は こ に の field concentrated し て い た. さ ら に mammalian cells に お い て PI (3, 5) P2 の intracellular distribution を 検 cable し た と こ ろ, identifies は エ ン ド ソ ー ム others の intracellular vesicular に limit bureau し て い た. こ の vesicular は な fine tubular の swelled structure of 徴 を have し て お り, late エ ン ド ソ ー ム の マ ー カ ー で あ る RAB7 positive で あ っ た. Detailed に 観 examine す る と, PI (3, 5) P2 の identification は こ の lug boss か ら は exclude さ れ る tendency に あ り, vesicular に お い て concentrated し て い た. の above results か ら, PI (3, 5) P2 が differentiae を super え て ド メ イ ン shape distribution を の と る こ と が early め て Ming ら か に な っ た. This study を tong じ て, late エ ン ド ソ ー ム · リ ソ ソ ー ム に お い て PI (3, 5) P2 に rich む new た な functionary ド メ イ ン が exist す が る possibility in stopping さ れ る.

项目成果

脳科学辞典 脂質ラフト

脑科学词典脂筏

• 发表时间: 2013
• 作者: Tomoya Aoba;Takahito Kato;Tsuneo Suzuki;Tadachika Nakayama;Hisayuki Suematsu;and Koichi Niihara;青葉 知弥;高鳥翔;高鳥翔;高鳥翔
• 通讯作者: 高鳥翔

急速凍結・凍結割断レプリカ標識法による出芽酵母PI(3,5)P2の局在解析

通过快速冷冻/冷冻断裂复制标记法对酿酒酵母 PI(3,5)P2 进行定位分析

• 发表时间: 2014
• 作者: Tomoya Aoba;Takahito Kato;Tsuneo Suzuki;Tadachika Nakayama;Hisayuki Suematsu;and Koichi Niihara;青葉 知弥;高鳥翔
• 通讯作者: 高鳥翔

出芽酵母におけるホスホイノシチドPI(3,5)P2の局在解析

磷酸肌醇 PI(3,5)P2 在酿酒酵母中的定位分析

• 发表时间: 2013
• 作者: Tomoya Aoba;Takahito Kato;Tsuneo Suzuki;Tadachika Nakayama;Hisayuki Suematsu;and Koichi Niihara;青葉 知弥;高鳥翔;高鳥翔
• 通讯作者: 高鳥翔