シグナル伝達の場としてのサブオルガネラ脂質ドメインの可視化と機能的意義の解明

亚细胞器脂质结构域作为信号转导位点的可视化及其功能意义的阐明

基本信息

批准号：
12J10940
负责人：
高鳥翔
金额：
$ 2.32万
依托单位：
The University of Tokyo (2014)Nagoya University (2012-2013)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

膜分子がサブオルガネラのレベルで偏りをもって分布し機能的なドメインを形成しているとの仮説が広く受け入れられている。しかし個々の膜脂質の膜内分布を詳細に明らかにした例は限られている。そこで、膜脂質の分布解析に優れた急速凍結・凍結割断レプリカ標識法を応用して形態学的に膜ドメインの実証を目指した。本研究の開始時点で、ホスファチジルイノシトール(3,5)二リン酸（PI(3,5)P2）の詳細な細胞内分布は知られていなかった。しかし、PI(3)PとPI(3,5)P2に結合するATG18タンパク質をプローブとし、さらにPI(3)P特異的な結合能を示すp40phox PXドメインタンパク質を用いてPI(3)P結合性のみを競合的に阻害することにより、PI(3,5)P2特異的な標識が可能になった。次に、PI(3,5)P2発現量を増加させる高張液処理を施した出芽酵母にこの手法を適用した。PI(3,5)P2の標識は液胞膜に特異的に認められ、細胞由来サンプルにおいても本手法の有効性が示された。興味深いことに、高張液処理した液胞膜には膜タンパク質が排除された膜ドメインが認められ、PI(3,5)P2の標識はこの領域に集中していた。さらに哺乳類細胞においてPI(3,5)P2の細胞内分布を検索したところ、標識はエンドソーム様の細胞内小胞に限局していた。この小胞は特徴的な細管状の突起構造を有しており、後期エンドソームのマーカーであるRAB7陽性であった。詳細に観察すると、PI(3,5)P2の標識はこの突起部からは排除される傾向にあり、小胞部分において集中していた。以上の結果から、PI(3,5)P2が種差を超えてドメイン状の分布をとることが初めて明らかになった。本研究を通じて、後期エンドソーム・リソソームにおいてPI(3,5)P2に富む新たな機能的ドメインが存在する可能性が示唆される。

该假设被广泛接受，即膜分子在亚制剂和形成功能域的水平上分布。但是，只有几个详细的单个膜脂质内膜内分布的例子。因此，我们旨在通过应用快速的冷冻/冷冻裂解复制品标记方法来证明膜结构域形态学，这对于膜脂质分布分析非常有用。在本研究开始时，磷脂酰肌醇（3,5）二磷酸（PI（3,5）P2）的细胞内分布尚不清楚。但是，通过使用将PI（3）P和PI（3,5）P2结合的ATG18蛋白作为探针，并使用具有PI（3）P特异性结合能力的P40phox PX域蛋白，可以使用PI（3）Pixigiac Pixigic结合能力来竞争PI（3）PI（3）PI（3）PI（3）PI（3）PI（3）PI（3）PI（3）PI（3）PI（3）Pi（3）P特定的PS特异性结合。接下来，将该技术应用于用高渗液体处理的糖酵母，以增加PI的表达水平（3,5）P2。在液泡膜上特别观察到PI（3,5）P2的标记，表明该技术在细胞衍生的样品中的有效性。有趣的是，高渗性液体处理的液泡膜显示出一个膜结构域，具有排除的膜蛋白，并且在该区域将PI（3,5）P2的标记集中在该区域。此外，当搜索哺乳动物细胞中PI（3,5）P2的细胞内分布时，标记局限于内体样细胞内囊泡。囊泡具有独特的管状突出结构，是rab7阳性，是后期内体的标志物。在仔细观察时，PI（3,5）P2的标签倾向于将其排除在此突出之外，并集中在囊泡部分中。从以上结果来看，很明显，PI（3,5）P2以超出物种差异的范围方式分布。这项研究表明，内体溶酶体晚期可能存在富含PI（3,5）P2的新功能域。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

脳科学辞典脂質ラフト

脑科学词典脂筏

DOI：
发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
0
作者：
Tomoya Aoba;Takahito Kato;Tsuneo Suzuki;Tadachika Nakayama;Hisayuki Suematsu;and Koichi Niihara;青葉　知弥;高鳥翔;高鳥翔;高鳥翔
通讯作者：
高鳥翔

出芽酵母におけるホスホイノシチドPI(3,5)P2の局在解析

磷酸肌醇 PI(3,5)P2 在酿酒酵母中的定位分析