Type III restriction endonuclease EclP15I: Protein engineering to optimize its use in transcriptome analysis ("SuperSAGE")

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Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die DNA-Moleküle spezifisch zu spalten vermögen. EcoP15I ist eine TypIII-Restriktionsendonuklease, die für den endonukleolytischen Angriff auf die DNA das Vorhandensein von zwei unmethylierten Kopien der nicht-palindromischen Erkennungssequenz 5-CAGCAG voraussetzt, die im DNA-Molekül invers zueinander orientiert sein müssen. Aus den vorausgegangenen Untersuchungen haben wir ein Modell zur molekularen DNA-Enzym-Wechselwirkung entwickelt. Zwei weitere Besonderheiten des Enzyms - das Vorhandensein repetitiver Triplets in der Erkennungssequenz und der vom DNA-Erkennungsort entfernt gelegene Schnittort im DNA-Molekül - haben zu Ansätzen für molekulardiagnotische Nutzungen geführt: Der Detektion und Quantifizierung von Trinukleotid-Repeats für die Diagnostik genetisch bedingter neurodegenerativer Erkrankungen sowie der Gewinnung neuartig langer "tag" Sequenzen für die Analyse des zellulären Transkriptoms ("SuperSAGE"). Im hier beantragten Vorhaben soll die Anwendbarkeit der EcoP15I-gestützten "SuperSAGE" für die Transkriptomanalyse in virusinfizierten Zellen prinzipiell gezeigt werden. Ein zweiter Komplex der Arbeiten fokussiert sich auf die Identifizierung funktioneller Domänen bzw. Aminosäuren in den EcoP15I-Untereinheiten, die für die DNA-Bindung, die Katalyse des DNA-Doppelstrangbruches sowie die Protein-Protein-Kontakte verantwortlich sind. Ziel dieser Struktur-Funtkions-Analyse des Proteins ist ihre Nutzung für ein Proteinengineering, das zu einem neuen EcoP15I-Derivat mit einem noch größeren Abstand zwischen Erkennungs- und Schnittort in der DNA und damit zur Generierung noch längerer "tags" für die Transkriptom-Analyse führen soll.