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アプタマーテクノロジーを利用した新規高感度植物ウイルス・ウイロイド診断法の開発

利用适体技术开发新型高灵敏度植物病毒/类病毒诊断方法

基本信息

批准号：
14F04078
负责人：
佐野輝男
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Hirosaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

アプタマー選抜の中核技術となるSELEX法には様々な因子が関与するため、ランダムオリゴ配列の長さ、濃度、温度、分離方法などを最適化する必要がある。特異な高次構造を有する自己複製型RNA病原体であるウイロイドを標的とするアプタマーを選抜するためのSELEX法プロトコールの確立を目指し、以下の諸条件を最適化し、アプタマー候補配列の濃縮に成功した。まずビオチン化標的PSTVd分子に結合したssDNAはストレプトアビジンコート磁気ビーズで回収する。市販の数種類の磁気ビーズを試し、ダイナビーズM-270（インビトロジェン社）とダイナビーズC1（インビトロジェン社）を選定し、ダイナビーズT1/M280とマグネスフェアーSA-PMPs（プロメガ社）が相補鎖分離に効果的である結果を得た。次に、SELEX法の結合、洗浄、溶出緩衝液のモル濃度、処理条件、競合実験条件等を検討し、最終的に6.32ピコモルの弱結合コントロールと20塩基、30塩基、40塩基のランダムDNAライブラリーから15ラウンドのSELEX選抜で濃縮したssDNA集団と10倍段階希釈した陽性対照混合液を、62ピコモルの標的PSTVd分子が結合している磁気ビーズに加える実験条件を確立した。因みにこの時の標的分子と結合分子（アプタマー候補分子）の比率は約10：1になる。また、1、5、10ラウンド目のssDNA試料の一部をPCR－クローニング後、塩基配列を分析し、さらに、10ラウンド目の試料を次世代シークエンス・アンプリコン解析にかけ、集団内の多様性を分析し、アプタマー候補となりうる配列を濃縮することに成功した。

The SELEX method is used to optimize the length, concentration, temperature and separation method of the reaction factors. The following conditions were optimized for the successful concentration of self-replicating RNA pathogens by the SELEX method: PSTVd molecules bind to the target DNA. The results of the test of the number of magnetic fields in the market, such as M-270 and C1, were obtained. The results of the test of SA-PMPs were obtained. Next, the binding, washing, dissolution buffer concentration, treatment conditions, competition conditions, etc. of SELEX method were discussed. The final 6.32-fold weak binding buffer was 20-fold, 30-fold, 40-fold weak binding buffer. The SELEX method was concentrated to 10-fold positive control mixture. 62. PSTVd molecules are bound to each other and the conditions for their incorporation are established. The ratio of target molecule to binding molecule (candidate molecule) is about 10:1. After PCR analysis, base alignment analysis, cluster diversity analysis, candidate alignment and concentration of some ssDNA samples from the 1st, 5th, and 10th groups were successfully performed.