糖質加水分解酵素における糖転移反応の触媒機構－Ｘ線結晶構造解析による解明

碳水化合物水解酶转糖基反应的催化机制——X射线晶体结构分析阐明

• 批准号: 14J07951
• 负责人: 梅本 尚之
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tohoku University (2015)Kinki University (2014)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-25 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J07951/
• 关键词: 植物キチナーゼ; 糖転移活性; キチンオリゴ糖; 酵素合成; 糖オキサゾリン誘導体; Ｘ線結晶構造解析; トリプトファン残基; キチナーゼ

本年度では、ソテツ由来GH18キチナーゼ(CrChiA)の糖転移活性の発現に重要なアミノ酸残基の特定を行った。対象となった残基は、前年度に明らかにしたX線結晶構造から推定されたトリプトファン残基(Trp168)である。Trp168をアラニンに置換した変異型酵素を作製し、その糖転移活性への影響をHPLCで調べた。その結果、変異型酵素ではほぼ完全に糖転移活性が失われていることが明らかとなった。以上より、CrChiAの糖転移活性の発現にはTrp168が重要なアミノ酸残基であることが分かると同時に、アクセプター基質に対する結合力が重要であることが明らかとなった。以上の結果から、アクセプター基質に対する結合力を増強することで糖転移活性を増強できると考えた。糖転移活性の増強は、将来の酵素合成によるキチンオリゴ糖生産において非常に重要である。そこで、アクセプター結合サイトにTrp側鎖を導入した変異型酵素を作製し、糖転移活性への影響をHPLCで調べた。その結果、変異型酵素では顕著な糖転移活性の増強が確認された。このことから、糖転移活性の発現にはアクセプター基質に対する結合力が重要であることが証明された。次に、より効率的なキチンオリゴ糖合成の実現のために活性化基質である糖オキサゾリン誘導体[(GlcNAc)n-oxa]を用いることを考えた。(GlcNAc)n-oxaはGH18キチナーゼを用いたキチンオリゴ糖合成において非常に有効な基質である。しかし、原料となるキチンオリゴ糖の分離精製が困難であることから利用が難しかった。本研究ではキチンオリゴ糖混合物からの合成および分離精製に成功し、効率的な生産法を確立した。この(GlcNAc)n-oxaを用いて(GlcNAc)7の酵素合成を試みた。その結果、植物キチナーゼを用いたキチンオリゴ糖合成に初めて成功した。以上のことから、本研究は、有用糖質であるキチンオリゴ糖の安価で安定な生産につながるもの考えられ非常に意義あるものとなった。

This year で は, ソ テ ツ origin GH18 キ チ ナ ー ゼ (CrChiA) move の sugar planning activity の 発 に now important な ア ミ ノ acid residues の specific line を っ た. Like と seaborne な っ た residues は, before the annual に Ming ら か に し た X-ray crystal structure か ら presumption さ れ た ト リ プ ト フ ァ ン residues (Trp168) で あ る. Trp168 を ア ラ ニ ン に replacement し た を - different enzyme system し, そ の move sugar planning activity へ の influence を HPLC で adjustable べ た. そ の results, - different enzymes で は ほ ぼ entirely に sugar move planning activity が lost わ れ て い る こ と が Ming ら か と な っ た. Move above よ り, CrChiA の sugar planning activity の 発 now に は Trp168 が important な ア ミ ノ acid residues で あ る こ と が points か る と に, at the same time ア ク セ プ タ ー matrix に す seaborne る binding force が important で あ る こ と が Ming ら か と な っ た. の above results か ら, ア ク セ プ タ ー matrix に す seaborne る strong binding force を raised す る こ と で move sugar planning activity を raised strong で き る と exam え た. The <s:1> enhancement of sugar 転 migration activity <s:1>, the future synthesis of <s:1> enzymes によるキチ リゴ リゴ リゴ sugar production にお て て is very に important である. そ こ で, ア ク セ プ タ ー combining サ イ ト に Trp side chain を import し た - different enzyme し, sugar, planning to move the を cropping activity へ の influence を HPLC で adjustable べ た. The そ そ results showed that the variant enzyme で 顕 顕 顕 increased な sugar 転 migration activity が confirmed された. こ の こ と か ら move, sugar planning activity の 発 now に は ア ク セ プ タ ー matrix に す seaborne る binding force が important で あ る こ と が prove さ れ た. に, よ り sharper rate な キ チ ン オ リ ゴ sugar synthesis の be presently の た め に activeness matrix で あ る sugar オ キ サ ゾ リ ン inductor [(GlcNAc) n - oxa] used を い る こ と を exam え た. (GlcNAc) n - oxa は GH18 キ チ ナ ー ゼ を with い た キ チ ン オ リ ゴ sugar synthesis に お い て very に have sharper な matrix で あ る. The separation and refinement of raw materials となるキチ リゴ リゴ リゴ リゴ sugar が is difficult である <s:1> と ら ら ら ら ら ら utilization が is difficult った った った った. This study で は キ チ ン オ リ ゴ sugar mixture か ら の synthetic お よ び separation of refined に し success, the working rate な production method を establish し た. Youdaoplaceholder2 を (GlcNAc)n-oxaを synthesis with を て(GlcNAc)7 <s:1> enzyme を test みた. Youdaoplaceholder0 そ results: Plants キチナ キチナ ゼを ゼを synthesized に initial めて using そ たキチ <s:1> リゴ リゴ リゴ and successfully た た. Above の こ と か ら, this study は, useful sugar で あ る キ チ ン オ リ ゴ sugar の Ann 価 で stability な production に つ な が る も の exam え ら れ very に meaning あ る も の と な っ た.

项目成果

Crystal structures and inhibitor binding studies of plant class V chitinases: the cycad enzyme exhibits unique strutural and functional features.

植物 V 类几丁质酶的晶体结构和抑制剂结合研究：苏铁酶表现出独特的结构和功能特征。

• DOI: 10.1111/tpj.12785
• 发表时间: 2015
• 期刊: The Plant Journal
• 作者: Naoyuki Umemoto;Yuka Kanda;Takayuki Ohnuma;Takuo Osawa;Tomoyuki Numata;Shohei Sakuda;Toki Taira;and Tamo Fukamizo.
• 通讯作者: and Tamo Fukamizo.

シダ由来キチナーゼの結晶構造と機能解析

蕨类几丁质酶的晶体结构和功能分析

• 发表时间: 2014
• 作者: ○梅本尚之;大沼貴之;平良東紀;沼田倫征;深溝 慶
• 通讯作者: 深溝 慶

糖オキサゾリンの効率的精製法の確立と植物由来GH18キチナーゼを用いたキチンオリゴ糖の合成

糖恶唑啉高效纯化方法的建立及植物源GH18几丁质酶合成甲壳寡糖

• 发表时间: 2016
• 作者: 梅本尚之;野口真人;斎藤夏貴;大沼貴之;深溝 慶;正田晋一郎
• 通讯作者: 正田晋一郎

Moduration odf the transglycosylation activity of plant family GH18 chitinase by removing or introducng a tryptophan side chain

通过去除或引入色氨酸侧链调节植物家族 GH18 几丁质酶的转糖基活性

• 发表时间: 2015
• 期刊: FEBS Letter
• 作者: Umemoto N.;Ohnuma T.;Osawa T.;Numata T.;Fukamizo T.
• 通讯作者: Fukamizo T.

シダ由来Family GH18(クラスIII)キチナーゼの結晶構造と機能解析

蕨类植物 GH18（III 类）几丁质酶家族的晶体结构和功能分析

• 发表时间: 2014
• 作者: ○梅本尚之;大沼貴之;平良東紀;沼田倫征;深溝 慶
• 通讯作者: 深溝 慶