繊毛運動の三次元計測による軸糸内腕ダイニンの繊毛波形調節機構の解明

繊毛運動の駆動におけるダイニンの機能を定量するため、テトラヒメナ一繊毛の運動を可視化、計測できる実験系の開発、計測、及び軸糸ダイニンの一部を欠損したテトラヒメナの作製を行った。まずテトラヒメナ細胞表面をビオチン修飾し、これにアビジンで修飾した蛍光ビーズを付加することで繊毛を計測するプローブとした。次にこのテトラヒメナの繊毛運動を計測するため、マイクロピペット、マニピュレーター、及びインジェクターを用いた実験系を構築し、適当な陰圧により溶液を吸引することでマイクロピペット先端に生きたテトラヒメナを固定した。このテトラヒメナについて、繊毛表面に付加された蛍光ビーズの運動を三次元位置検出光学系を用いて計測することで、繊毛一本の運動を計測することができた。これにより、従来は往復運動をしていると考えられていた繊毛運動が、回転運動であることが明らかになった。現在、計測数を増やすことで繊毛運動の速度や波形の解析を進めている。また軸糸ダイニンの一部を欠損したテトラヒメナを作製した。これには、内在のダイニン遺伝子配列と組み替わり薬剤耐性遺伝子を挿入する遺伝子断片を金粒子に付加し、遺伝子銃によりテトラヒメナに打ち込む方法を用いた。テトラヒメナは大核中に同じ遺伝子を複数コピー持ち、この段階では内在性の遺伝子配列が残っているため、薬剤濃度を上げながら継代することで全てのコピーが組み換えられた変異体を選別する作業を現在おこなっている。これが終わり次第、上記の実験系を用いて軸糸ダイニンの欠損が繊毛運動に与える影響を解析する計画である。

繊毛運動の駆動におけるダイニンの機能を定量するため、テトラヒメナ一繊毛の運動を可視化、計測できる実験系の開発、計測、及び軸糸ダイニンの一部を欠損したテトラヒメナの作製を行った。まずテトラヒメナ細胞表面をビオチン修飾し、これにアビジンで修飾した蛍光ビーズを付加することで繊毛を計測するプローブとした。次にこのテトラヒメナの繊毛運動を計測するため、マイクロピペット、マニピュレーター、及びインジェクターを用いた実験系を構築し、適当な陰圧により溶液を吸引することでマイクロピペット先端に生きたテトラヒメナを固定した。このテトラヒメナについて、繊毛表面に付加された蛍光ビーズの運動を三次元位置検出光学系を用いて計測することで、繊毛一本の運動を計測することができた。これにより、従来は往復運動をしていると考えられていた繊毛運動が、回転運動であることが明らかになった。現在、計測数を増やすことで繊毛運動の速度や波形の解析を進めている。また軸糸ダイニンの一部を欠損したテトラヒメナを作製した。これには、内在のダイニン遺伝子配列と組み替わり薬剤耐性遺伝子を挿入する遺伝子断片を金粒子に付加し、遺伝子銃によりテトラヒメナに打ち込む方法を用いた。テトラヒメナは大核中に同じ遺伝子を複数コピー持ち、この段階では内在性の遺伝子配列が残っているため、薬剤濃度を上げながら継代することで全てのコピーが組み換えられた変異体を選別する作業を現在おこなっている。これが終わり次第、上記の実験系を用いて軸糸ダイニンの欠損が繊毛運動に与える影響を解析する計画である。