ＤＮＡおよびＤＮＡ代謝酵素の１分子蛍光観測による動態解析

利用单分子荧光观察动态分析 DNA 和 DNA 代谢酶

• 批准号: 15J07154
• 负责人: 高橋 俊介
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J07154/
• 关键词: １分子観察; ＤＮＡ形態制御; ＤＮＡ代謝反応; ＤＮＡ複製; ＤＮＡ超らせん; ＤＮＡポリメラーゼ; マイクロ流路; 基板表面修飾; DNA形態制御; DNA複製; 微細流路; １本鎖DNA; DNAポリメラーゼ; 超らせん

これまでの多くの生化学的な研究により、DNAに作用するタンパク質群が網羅され、これらのタンパク質間相互作用を中心とするタンパク質機能解析が精力的に行われた結果、DNA代謝反応の分子モデルが提唱されるに至っている。これらの研究の多くは、試験管内反応産物をゲル電気泳動法により解析することに依っている。試験管内の反応溶液には数百万以上のDNA及びタンパク質の分子が含まれているため、そこから得られた結果は多分子の挙動の平均値の情報しか反映しておらず、個々の分子の揺らぎの影響を解析することは困難である。また、試験管内実験ではDNA代謝反応の中間過程の素反応の実態を明らかにすることが難しい。そのため、DNA代謝反応の分子機構には未だ不明な部分が多く残されてる。上記の問題点の解決には、微小反応場の制御が可能な微細流路装置、DNAの１分子操作が可能な磁気ピンセット装置、高感度カメラを装備した蛍光顕微鏡装置の組合せから構成された１分子蛍光観察装置を用い、DNAの形態を制御すること、DNA及びタンパク質を蛍光標識することが有効である。そこで、本研究では上記の１分子蛍光観察に必要な装置及び技術を駆使し、１分子レベルにてDNAポリメラーゼによるDNA合成反応、負の超らせんがDNA複製反応の開始に与える影響を直接観察により評価した。主な研究実績として、１分子レベルの蛍光観察による負の超らせんがDNA複製開始に与える影響の解析に関する研究では、負の超らせん密度の増加がSimian virus 40 (SV40) DNA複製反応の開始を上昇させること、負の超らせんがSV40ラージT抗原（DNA複製開始とDNAヘリカーゼの機能を合わせ持つ複製因子）によるDNA鎖巻き戻し反応を促進させることなど、負の超らせんがSV40DNA複製開始の制御に重要な役割を果たすことを示唆する結果が得られた。上記の研究成果は査読付国際学術誌Journal of Biomolecular Structure and Dynamics誌にて発表した。

This is the result of many biochemical studies, DNA interactions, molecular interactions, molecular interactions, and energy analysis. This study is based on the analysis of the reaction products in the tube by electrokinetic method. It is difficult to analyze the influence of DNA and DNA molecules in the reaction solution containing millions of DNA molecules. It is difficult to understand the state of the intermediate process of DNA metabolism in vitro. The molecular mechanism of DNA metabolism is unknown. To solve the above problems, it is possible to control micro reflection field, micro-channel device, DNA molecular manipulation, magnetic detection device, high-sensitivity optical microscope device, combination structure of molecular optical detection device, DNA morphology control, DNA and molecular quality optical identification. This study notes the importance of molecular light detection, equipment and techniques, and direct detection of DNA replication and its effects on DNA synthesis. The main results of this study are as follows: (1) DNA replication initiation and its effect on the detection of DNA replication in the presence of 1 molecule of DNA;(2) DNA replication initiation and its effect on the detection of 1 molecule of DNA;(3) DNA replication initiation and its effect on the detection of 1 molecule of DNA;(4) DNA replication initiation and its effect on the detection of 1 molecule of DNA replication initiation and its effect on the detection of 1 molecule of DNA replication initiation and its effect on the detection of 1 molecule of Simian virus 40 (SV 40);(5) DNA replication initiation and its effect on 1 molecule of Simian virus 40 (SV40);(6) DNA replication initiation and its effect on 1 molecule of Simian virus 40 (SV40);(7) DNA replication initiation and its effect on 1 molecule of Simian virus 40 (SV40). The negative supergene SV40 T antigen (DNA replication initiation, DNA replication function, and replication factor) is responsible for DNA replication initiation, DNA replication initiation, and DNA replication inhibition. The results of this study were reviewed in the Journal of Biomolecular Structure and Dynamics.

项目成果

蛍光T4 DNA Ligaseの1分子解析の試み

荧光T4 DNA连接酶的单分子分析尝试

• 发表时间: 2016
• 作者: 小和瀬聡実;碓井智大;高橋俊介;川崎祥平;栗田弘史;水野彰;大重真彦;桂進司
• 通讯作者: 桂進司

DNAおよびDNA代謝酵素の1分子蛍光観察による動態解析

利用单分子荧光观察动态分析 DNA 和 DNA 代谢酶

• 发表时间: 2015
• 作者: 高橋俊介;川崎祥平;栗田弘史;水野武;松浦俊一;水野彰;大重真彦;桂進司
• 通讯作者: 桂進司

大腸菌由来DNAポリメラーゼによるDNA合成反応の1分子解析

大肠杆菌 DNA 聚合酶 DNA 合成反应的单分子分析

• 发表时间: 2016
• 作者: 柳基成;高橋俊介;川崎祥平;栗田弘史;松浦俊一;水野彰;大重真彦;桂進司
• 通讯作者: 桂進司

１分子レべルの蛍光観察による負の超らせんがSV40DNA複製反応の開始に与える影響の評価

单分子水平荧光观察评价负超螺旋对SV40 DNA复制反应启动的影响

• 发表时间: 2016
• 作者: 高橋俊介;本岡伸也;川崎祥平;栗田弘史;水野武;松浦俊一;花岡文雄;水野彰;大重真彦;桂進司
• 通讯作者: 桂進司

Direct Single-Molecule Observations of DNA Synthesis and Digestion Reactions

DNA 合成和消化反应的直接单分子观察

• 发表时间: 2015
• 作者: Takahashi;S.;Kawasaki;S.;Kurita;H.;Mizuno;T.;Matsuura;S-I.;Mizuno;A.;Oshige;M.;Katsura;S.
• 通讯作者: S.