トキソプラズマにおける宿主オルガネラリクルート機構の解析

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昨年度は過剰発現株を使用したタンパク質の局在解析と宿主ミトコンドリアの誘引率の定量より、3つのリクルート因子を同定した。このうちノックアウト(KO)可能なROP39をCRIPR/Cas9系でノックアウトしたROP39KO原虫を用いて表現型解析を行なった。具体的には、ROP39KO原虫の宿主ミトコンドリアの誘引率、増殖速度、マウスに対する毒性を親株と比較した。予想どおり、ROP39KO原虫では宿主ミトコンドリアの誘引率と増殖速度が親株と比較して有意に低下していた。また、ROP39KO原虫はマウスに対する毒性においても親株と比較して有意に低下していた。さらに、ROP39のキナーゼ活性部位を欠損させたROP39遺伝子を導入したKO原虫は毒性がコンプリメント株と比較して有意に回復しなかった事から、ROP39はキナーゼ活性を介してマウスに対する毒性を示している事を示唆することが出来た。次に、宿主細胞にROP39を発現させて、原虫が存在しない状況下でもROP39は宿主ミトコンドリアと結合するかどうかを確かめた。結果、ROP39は宿主ミトコンドリアと部分的に共局在した。この事は、ROP39自身が宿主のミトコンドリアと結合する能力を有している事、結合には原虫の他の因子の助けが必要ない事を示唆している。KO不可能である残り2つのリクルート因子に関しては、Tet-off系を用いたコンディショナルノックダウンを行なって表現型解析の解析を行う予定である。Tet-off系に必要な原虫や、必要となるプラスミドの構築はすでに完了している。