グリア機能の操作と計測による脳内異種細胞間ネットワーク機構の解明

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種々の標本を用いて、細胞質局在型のpHセンサーの性能評価を行った。脳スライス標本において、電気刺激により誘発した神経活動に伴い、周辺のグリア細胞がアルカリ化すること、またグリア初代培養細胞において、D-アスパラギン酸投与によりグリア細胞内が酸性化することが確認された。上記２点は従来の報告にある現象と一致しており、作製したpHセンサーが期待通りに動作しており、脳内のグリア細胞内pHの計測が可能であることが確認された。一方で、細胞質局在型のセンサーでは、特に観察対象としたい神経細胞近傍を取り巻くグリア微細突起構造上のpH変化をとらえるには、発現パターンが適していないことも明らかになった。このため、当該年度においては新たに、細胞膜上に限局して発現するタイプのpHセンサーの設計、開発、および遺伝子改変マウスへの実装を行った。細胞膜局在シグナルとしては、過去にカルシウムセンサーG-CaMPとに付加して用いられた実績のある配列を応用し、これをpHセンサーのN末端側に付加した発現ベクターを作製した。この発現ベクターをHEK293T細胞にトランスフェクションした際、pHセンサーが発する蛍光が細胞膜上に局在することを確認した。また発現局在確認の後、pH計測機能の確認実験を行い、pH7.4付近で線形に蛍光強度比が変化することが確認された。このセンサーを用いて脳内環境の生理的変化に伴うグリア細胞内pHの変化を計測可能であると考えられたため、このpHセンサーを発現する遺伝子改変マウスの作出に着手する予定である。