遺伝子改変動物を用いた精子成熟における後付けタンパク質の機能解析

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哺乳類精子の形態は精巣内で完成するが、精巣精子は受精能力を持っていない。精子の受精能力は、精子が精巣の隣に存在する精巣上体と呼ばれる管を通過するときに、精巣上体から分泌されるタンパク質の働きによってはじめて獲得される。本研究は、精巣精子が精巣上体から分泌されるタンパク質の作用によってどのように受精能力を獲得するのか、その分子メカニズムの解明を最終目標とした。そこで、主に精巣上体で発現し、雄の妊よう性に関わることが示唆されている遺伝子クラスターXに注目した。遺伝子クラスターXの大きさは1 Mbを超えて、10以上の遺伝子が存在する。そこで、CRISPR/Cas9システムを使ったES細胞でのゲノム編集で、この領域を欠損するマウスの作製を試みた。具体的には、この領域の上流と下流に存在する遺伝子をそれぞれ標的とする2種類のsgRNA/Cas9発現プラスミドを、リポフェクタミン法によりES細胞へトランスフェクションした。得られたクローンからゲノムDNAを抽出し、標的領域を跨いで増幅するようなプライマーセットを設計してPCRを行った。その結果、48クローン中21クローンで長鎖領域の欠損が検出できた。その内5クローンのPCR産物をダイレクトシークエンスしたところ、5クローン全てで遺伝子クラスターXの標的領域を欠損していた。正常な核型（８０％以上）を示した3クローンを8細胞期胚へ注入した結果、それぞれ14匹、7匹、0匹のキメラマウスを得た。キメラマウス雄を野生型雌と交配させ、遺伝子クラスターXの標的領域をヘテロ欠損した次世代が得られた。ヘテロ変異マウス同士の交配から、ホモ変異雄マウスが得られ、性成熟するまで正常に成長した。現在は、ホモ変異雄マウスの妊孕性を交配試験により調べている。