遺伝子改変動物を用いた精子成熟における後付けタンパク質の機能解析

使用转基因动物对精子成熟过程中添加的蛋白质进行功能分析

• 批准号: 16J04613
• 负责人: 野田 大地
• 金额: $ 2.08万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J04613/
• 关键词: 精巣上体

哺乳類精子の形態は精巣内で完成するが、精巣精子は受精能力を持っていない。精子の受精能力は、精子が精巣の隣に存在する精巣上体と呼ばれる管を通過するときに、精巣上体から分泌されるタンパク質の働きによってはじめて獲得される。本研究は、精巣精子が精巣上体から分泌されるタンパク質の作用によってどのように受精能力を獲得するのか、その分子メカニズムの解明を最終目標とした。そこで、主に精巣上体で発現し、雄の妊よう性に関わることが示唆されている遺伝子クラスターXに注目した。遺伝子クラスターXの大きさは1 Mbを超えて、10以上の遺伝子が存在する。そこで、CRISPR/Cas9システムを使ったES細胞でのゲノム編集で、この領域を欠損するマウスの作製を試みた。具体的には、この領域の上流と下流に存在する遺伝子をそれぞれ標的とする2種類のsgRNA/Cas9発現プラスミドを、リポフェクタミン法によりES細胞へトランスフェクションした。得られたクローンからゲノムDNAを抽出し、標的領域を跨いで増幅するようなプライマーセットを設計してPCRを行った。その結果、48クローン中21クローンで長鎖領域の欠損が検出できた。その内5クローンのPCR産物をダイレクトシークエンスしたところ、5クローン全てで遺伝子クラスターXの標的領域を欠損していた。正常な核型（８０％以上）を示した3クローンを8細胞期胚へ注入した結果、それぞれ14匹、7匹、0匹のキメラマウスを得た。キメラマウス雄を野生型雌と交配させ、遺伝子クラスターXの標的領域をヘテロ欠損した次世代が得られた。ヘテロ変異マウス同士の交配から、ホモ変異雄マウスが得られ、性成熟するまで正常に成長した。現在は、ホモ変異雄マウスの妊孕性を交配試験により調べている。

Mammalian sperm morphology is complete within the sperm, and sperm fertility is maintained. Sperm fertilization ability, sperm production, sperm production. The aim of this study is to clarify the role of sperm in sperm secretion and fertilization. The main body of the body appears, the male body of the body appears, and the female body of the body appears. A large number of copies of the file are available at 1 Mb and 10 Mb. The CRISPR/Cas9 system allows ES cells to be programmed and controlled in the field. The two types of sgRNA/Cas9 gene expression vectors are present in the upstream and downstream regions of ES cells. DNA extraction, target area, amplification, design, PCR The results of the test, 48, 21, 2 The PCR products of the five genes in the five genes were found to be deficient in the target domain. Normal karyotype (more than 80%) showed that 3 cells were injected into 8 cells, and 14, 7, and 0 cells were injected into 8 cells. The wild type females mate with the wild type males, and the wild type females mate with the wild type males. It is a normal growth process for male and female. Now, it's a male pregnancy test.

项目成果

オス繁殖能力における精嚢腺分泌タンパク質の機能解析

精囊分泌蛋白在男性生育力中的功能分析

• 发表时间: 2016
• 作者: Oji A;Noda T;Fujihara Y;Miyata H;Kim YJ;Muto M;Nozawa K;Matsumura T;Isotani A;Ikawa M.;野田 大地，藤原 祥高，松村 貴史，伊川 正人
• 通讯作者: 野田 大地，藤原 祥高，松村 貴史，伊川 正人

実験医学 別冊「マウス表現型解析スタンダード」

实验医学专刊《小鼠表型分析标准》

• 发表时间: 2016
• 作者: 長野清一;金井雅裕;永井義隆
• 通讯作者: 永井義隆

実験医学増刊 All About ゲノム編集

关于基因组编辑的实验医学特刊

• 发表时间: 2016
• 作者: 野田大地;大字亜沙美;伊川正人
• 通讯作者: 伊川正人

CRISPR/Cas9 mediated genome editing in ES cells and its application for chimeric analysis in mice.

• DOI: 10.1038/srep31666
• 发表时间: 2016-08-17
• 期刊: Scientific reports
• 影响因子: 4.6
• 作者: Oji A;Noda T;Fujihara Y;Miyata H;Kim YJ;Muto M;Nozawa K;Matsumura T;Isotani A;Ikawa M
• 通讯作者: Ikawa M

大阪大学微生物病研究所遺伝子機能解析分野

大阪大学微生物疾病研究所基因功能分析科