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ゲノム編集技術を用いたブタ胚着床促進因子の同定と効率的家畜生産技術への応用

基因组编辑技术识别猪胚胎着床促进因素及其在高效畜牧生产技术中的应用

基本信息

批准号：
17J11050
负责人：
鴨下真紀
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Azabu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

・ブタ前核期胚のLIF gRNAおよびCas9 mRNA/タンパク質注入条件の検討食肉処理場由来の卵巣より回収した未成熟卵を体外成熟培養し、得られた成熟卵を凍結融解精子と体外受精し、前核期胚を得た。様々な濃度のgRNAとCas9 mRNAを注入した前核期胚の胚盤胞率およぼ胚盤胞でのゲノム変異率を調べたところ、5 ng/uLから50 ng/uLまでのgRNAおよびCas9 mRNA注入濃度はブタ前核期胚の胚盤胞への発生率に影響を及ぼさないことを示したが、変異導入効率では25 ng/uLが50%と最も高いことが明らかになった。同様に、ブタ前核期胚のLIF gRNAおよびCas9タンパク質注入条件を検討したところ、胚盤胞率では試験区間に有意な差はみられなかったが、25および50 ng/uLでは高い効率でゲノム変異胚が得られた。・ガラス化保存したブタ前核期胚のLIF gRNAおよびCas9 mRNA/タンパク質注入試験体外生産由来のブタ前核期胚を多量に作出するのは容易ではなく、個体作出を目的とした胚移植に用いる胚をより効率的に準備する必要が求められた。そこで新規凍害保護物質であるCOOH-PLLを添加したガラス化保存液を用いてブタ前核期胚をガラス化保存し、加温後に同様の方法でLIF gRNAおよびCas9 mRNA/タンパク質を注入し、胚盤胞への発生能を調べた。その結果、gRNAおよびCas9 mRNAあるいはタンパク質を注入したガラス化保存前核期胚は胚盤胞へ発生し、さらにゲノム変異胚を確認した。ガラス化保存したブタ前核期胚を用いて顕微注入を行い、その後に胚盤胞への発生を確認したのは本研究がはじめてであり、さらに低率ながらゲノム変異胚が作製できることもはじめて明らかになった。

・LIF gRNA for pronuclear stage embryos Cas9 The conditions for the injection of mRNA/タンパク are as follows: the origin of the meat processing site is the recovery of immature eggs, in vitro maturation and culture, and the preparation of mature eggs, freezing and thawing of sperm and in vitro fertilization, and the preparation of prenuclear stage embryos.様々なconcentrationのgRNAととをinjectionしたpronuclear stage embryoのblastoderm cell rateおよぼblastoderm cellsでのゲノム変differential rateをadjustedべたところ、5 ng/uLから50 The injection concentration of ng/uL gRNA and Cas9 mRNA has no effect on the blastoderm cells of the pronuclear stage embryo and the blastoderm growth rate. ng/uLが50%と最も高いことが明らかになった. LIF of the same 様に and ブタ prenuclear stage embryos gRNA およびCas9 タンパク mass injection conditions を検したところ, blastoderm cell rate では test range にmeaningful difference はみられなかったが, 25 および50 ng/uL is high in efficiency and high in efficiency.・LIF gRNA of したブタ prenuclear stage embryos preserved by ガラスおよびCas9 The origin of the in vitro production of mRNA/mRNA plasmid injection test is that it is easy to produce a large amount of prenuclear stage embryos and it is easy to produce It is necessary to prepare the embryo for the purpose of the embryo transfer and to use the embryo to achieve the efficiency of the individual.そこでNew regulation of freezing damage protection material であるCOOH-PLLをadded したガラス化 preservation solutionをいてブタprenuclear stage embryos をガラス oxidation preservationし, after heating, the same method as the 様のLIF gRNA およびCas9 mRNA/タンパク性をInjectionし, blastoderm cells への発生 Energy を Adjustment べた.そのRESULTS, gRNA およびCas9 Injection of mRNA into the sterile material will preserve the prenuclear stage embryos and blastoderm cells and confirm the heteroembryism. The prenuclear stage embryos are preserved by sterilization and are micro-injected into the prenuclear stage, and the blastoderm cells are confirmed after microinjection. Research on がはじめてであり and さらにlow rate ながらゲノム変different embryo が production できることもはじめて明らかになった.