ゲノム編集技術を用いたブタ胚着床促進因子の同定と効率的家畜生産技術への応用

基因组编辑技术识别猪胚胎着床促进因素及其在高效畜牧生产技术中的应用

基本信息

批准号：
17J11050
负责人：
鴨下真紀
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Azabu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

・ブタ前核期胚のLIF gRNAおよびCas9 mRNA/タンパク質注入条件の検討食肉処理場由来の卵巣より回収した未成熟卵を体外成熟培養し、得られた成熟卵を凍結融解精子と体外受精し、前核期胚を得た。様々な濃度のgRNAとCas9 mRNAを注入した前核期胚の胚盤胞率およぼ胚盤胞でのゲノム変異率を調べたところ、5 ng/uLから50 ng/uLまでのgRNAおよびCas9 mRNA注入濃度はブタ前核期胚の胚盤胞への発生率に影響を及ぼさないことを示したが、変異導入効率では25 ng/uLが50%と最も高いことが明らかになった。同様に、ブタ前核期胚のLIF gRNAおよびCas9タンパク質注入条件を検討したところ、胚盤胞率では試験区間に有意な差はみられなかったが、25および50 ng/uLでは高い効率でゲノム変異胚が得られた。・ガラス化保存したブタ前核期胚のLIF gRNAおよびCas9 mRNA/タンパク質注入試験体外生産由来のブタ前核期胚を多量に作出するのは容易ではなく、個体作出を目的とした胚移植に用いる胚をより効率的に準備する必要が求められた。そこで新規凍害保護物質であるCOOH-PLLを添加したガラス化保存液を用いてブタ前核期胚をガラス化保存し、加温後に同様の方法でLIF gRNAおよびCas9 mRNA/タンパク質を注入し、胚盤胞への発生能を調べた。その結果、gRNAおよびCas9 mRNAあるいはタンパク質を注入したガラス化保存前核期胚は胚盤胞へ発生し、さらにゲノム変異胚を確認した。ガラス化保存したブタ前核期胚を用いて顕微注入を行い、その後に胚盤胞への発生を確認したのは本研究がはじめてであり、さらに低率ながらゲノム変異胚が作製できることもはじめて明らかになった。

- 检查猪胚胎的LIF GRNA和Cas9 mRNA/蛋白质注射条件。在体外培养了从特应治疗设施中从卵巢中收集的未成熟卵，并用冷冻和解冻的精子受精产生的成熟卵以获得核胚胎。研究了注入各种浓度的GRNA和Cas9 mRNA的前核阶段胚胎中的胚泡速率和基因组突变率，尽管GRNA和CAS9 mRNA注射浓度从5 ng/ul到50 ng/ul并未影响牛仔孔核心期胚胎的发病率，但发现25 ng/ul是50 ng/ul的最高效率。同样，在检查猪倾斜胚胎中的LIF GRNA和CAS9蛋白注射条件时，在测试间隔之间未发现胚泡速率的显着差异，但是在25和50 ng/ul的效率高效率下获得了基因组突变的胚胎。 - 产生大量的猪前核胚胎，这些猪核心胚胎是从体外生产中产生的玻璃化和保存的猪核胚胎，因此有必要准备更有效的胚胎以用于胚胎转移以创建个体。因此，使用含有COOH-PLL的玻璃化保存溶液（一种新型的冷冻保护物质）将猪的前核分期胚胎玻璃化并储存，并在变暖后，以相同的方式注入LIF GRNA和Cas9 mRNA/蛋白质，以检查囊泡细胞的发育潜力。结果，注入GRNA和Cas9 mRNA或蛋白质的玻璃化核前胚胎已发展为胚泡，并进一步证实了基因组突变的胚胎。这是该研究首次使用玻璃化的，保存的猪前核心胚胎进行显微注射，随后证实了胚泡的发展，而且很明显，基因组突变的胚胎可以以低速率产生。