網羅的解析を用いた、ＫＳＨＶとＥＢＶの溶解感染機構の比較と解明

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)およびEpstein-Barrウイルス(EBV)は共にγヘルペウスウイルス亜科に属するヒト癌ウイルスである。ヒトヘルペスウイルスに対してアシクロビルは高い選択性と強い抗ウイルス活性を示すが、γヘルペスウイルス感染症に関しては例外的に有効な治療薬がなく、全世界で特に深刻な問題となっている。 申請者はこれまでの研究において、関連する宿主因子が同定されていないためにKSHV溶解感染機構が解明されていないという問題を解決すべく網羅的プロテオーム解析を行い、KSHVが溶解感染へ移行する際に発現量の変化する宿主因子を網羅的に探索した。その結果、ユビキチン様タンパク質(UBLs)であるFAT10に関連するタンパク群が顕著に発現増加することを発見した。FAT10についてウエスタンブロット法およびRT-定量的PCR法にて確認したところ、やはりKSHV溶解感染において発現が顕著に上昇していたことが確認された。さらにCRISPR/Cas9を用いてUBE1L2をノックアウトしたところ、KSHVの粒子産生が顕著に低下した。そのため、UBE1L2-FAT10はKSHVの粒子形成に関わる可能性があることが示唆された。次に、ターゲットタンパクを探索するために、抗FAT10抗体を用いて免疫沈降を行い沈降物に関して質量分析を行った。同時に、Hisタグ標識されたFAT10の発現プラスミドを作製し、KSHV溶解感染を誘導した細胞に導入した上でプルダウンアッセイを行い、沈降物について質量分析を行った。これら2種類の質量分析で得られたデータを解析し、共通してヒットしてきた候補因子をピックアップした結果、KSHVの数種類のウイルスタンパク質が得られた。これらののタンパク質についてプルダウンアッセイを行ったところ、FAT10との結合が確認された。

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)およびEpstein-Barrウイルス(EBV)は共にγヘルペウスウイルス亜科に属するヒト癌ウイルスである。ヒトヘルペスウイルスに対してアシクロビルは高い選択性と強い抗ウイルス活性を示すが、γヘルペスウイルス感染症に関しては例外的に有効な治療薬がなく、全世界で特に深刻な問題となっている。 申請者はこれまでの研究において、関連する宿主因子が同定されていないためにKSHV溶解感染機構が解明されていないという問題を解決すべく網羅的プロテオーム解析を行い、KSHVが溶解感染へ移行する際に発現量の変化する宿主因子を網羅的に探索した。その結果、ユビキチン様タンパク質(UBLs)であるFAT10に関連するタンパク群が顕著に発現増加することを発見した。FAT10についてウエスタンブロット法およびRT-定量的PCR法にて確認したところ、やはりKSHV溶解感染において発現が顕著に上昇していたことが確認された。さらにCRISPR/Cas9を用いてUBE1L2をノックアウトしたところ、KSHVの粒子産生が顕著に低下した。そのため、UBE1L2-FAT10はKSHVの粒子形成に関わる可能性があることが示唆された。次に、ターゲットタンパクを探索するために、抗FAT10抗体を用いて免疫沈降を行い沈降物に関して質量分析を行った。同時に、Hisタグ標識されたFAT10の発現プラスミドを作製し、KSHV溶解感染を誘導した細胞に導入した上でプルダウンアッセイを行い、沈降物について質量分析を行った。これら2種類の質量分析で得られたデータを解析し、共通してヒットしてきた候補因子をピックアップした結果、KSHVの数種類のウイルスタンパク質が得られた。これらののタンパク質についてプルダウンアッセイを行ったところ、FAT10との結合が確認された。