動物の動脈硬化における免疫グロブリンと脂質代謝関連分子の役割について

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本年度は、採用1-2年目の結果を踏まえてアミロイド構成蛋白質としてアポリポ蛋白(Apo)A1と免疫グロブリンに候補を絞り、免疫組織化学的および生化学的手法でアミロイド構成蛋白質を同定することを目標とした。さらに、脂質沈着と免疫グロブリンの役割を解明するため、変性リポ蛋白に対する抗体の有無を検索した。採用1年目の質量分析でApoA1のC末側ペプチドが検出されたことから、ApoA1のC末ペプチドに対する抗体を作成した。この自作抗体および免疫グロブリンに対する市販抗体を用いて、水抽出法で得たアミロイド抽出物のウェスタンブロット解析を行った。その結果、アミロイド抽出物から全長のApoA1やκ鎖より低分子量のApoA1のC末端、N末端およびκ鎖が検出された。一方、同一個体の血清中にこれらの断片化したApoA1やκ鎖は検出されなかった。また、アミロイド線維や血管アミロイドの電子顕微鏡観察では9-15nmの繊維状構造物が観察され、繊維状構造物に近接して脂質と思われる空隙が観察された。さらに、変性リポ蛋白に対する自己抗体の有無をウェスタンブロット解析および蛍光二重免疫染色で検索したところ、血管アミロイド症例の血清中に酸化LDLに対する抗体が検出された。これらのことから、イヌの血管アミロイドは断片化したApoA1やκ鎖がアミロイド構成蛋白であることや、脂質沈着に関連してアミロイド線維が形成されること、さらには罹患犬の血清中では抗酸化LDL抗体が増加する可能性が考えられた。