Optimiertes ß-Faltblattmodul für die effektive Expression von Fab-Fragmenten in E.coli

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Das vorliegende Projekt hat zum Ziel, durch die Erzeugung von Zufallsmutationen sowie durch lokale Randomisierungen spezieller Positionen in den konstanten ß -Faltblatt-Domänen der leichten und schweren Kette eines Fab-Fragments mit anschließender Selektion von im Periplasma bevorzugt exprimierten Varianten mittels Phage-Display Aminosäurepositionen zu identifizieren, die für eine optimale Faltung, Stabilität und Ausbeute des kompletten Fragments vonBedeutung sind.Als Modell sollen die variablen Regionen des murinen anti-p24 (HIV-1) Antikörpers CB4-1 in Verbindung mit partiell randomisierten bzw. mutierten murinen und humanen konstanten Domänen verwendet werden. Als Target für die Selektion dient das Epitoppeptid des CB4-1. Für selektierte Fab-Varianten dieses Antikörpers sollen folgende Parameter analysiert werden: Proteinausbeute der Expression, Affinität zum Epitoppeptid, Faltungskinetik, Stabilität und strukturelle Parameter, wobei die strukturelle Charakterisierung Aufschluß über die Bedeutung lokaler Interaktionen auf das Faltungsverhalten und die Gesamtstabilität des ß -Faltblatts geben soll. Durch Kombination der optimierten konstanten Domänen mit weiteren variablen Domänen unterschiedlicher Spezifität soll die generelle Verwendbarkeit solcher ß -Faltblattmodule für die Expressionsoptimierung von Fab-Fragmenten untersucht werden.