バキュロウイルスによる宿主行動操作の神経基盤の解明

本研究は、ウイルス感染脳における宿主の発現変動遺伝子（Differentially Expressed Gene: DEG）およびその発現ニューロンの詳細な機能解析を行うことにより、バキュロウイルスが宿主昆虫の脳内の行動中枢を利己的に操作する分子・神経メカニズムを解明することを目標とする。昨年度までに、カイコ培養細胞にCRISPR/Cas13dシステムを導入し、その有効性を実証した。そこで、今年度はCRISPR/Cas13dによるカイコ内在性遺伝子ノックダウン細胞のRNA-seq解析を行ったところ、Cas13d/gRNAの発現により標的遺伝子のmRNAを効率的かつ配列特異的に切断できるが、切断後のRNA断片が少なからず残留することが明らかになった。また、カイコ培養細胞においてCas13d/gRNAを発現させると細胞増殖の減少やhouse-keeping遺伝子の発現低下が見られることが判明した。これらの細胞では一部のトランスポゾンの発現が顕著に上昇していたことから、Cas13d/gRNAがsmall RNA経路に干渉してトランスポゾンの抑制が緩くなったと予想される。したがって、カイコではこうした点を考慮した上でCRISPR/Cas13dを使用する必要があり、今後はこれらの欠点を改善することでツールとしての利便性が上がると考えている。また、今年度はDEGの詳細な機能解析を行うため、ノックイン(TAL-PITCh法)によりDEG発現細胞特異的に外来遺伝子を発現誘導できるGAL4カイコの作出を試みた。しかし、得られたGAL4系統では全くGAL4発現を誘導できなかった。昨年度には中枢神経系特異的遺伝子(nSyb)のGAL4カイコも同様の結果であったことから、カイコにおいては5'UTR領域へのノックインでは標的遺伝子の発現パターンを模倣することが極めて難しい可能性がある。

本研究は、ウイルス感染脳における宿主の発現変動遺伝子（Differentially Expressed Gene: DEG）およびその発現ニューロンの詳細な機能解析を行うことにより、バキュロウイルスが宿主昆虫の脳内の行動中枢を利己的に操作する分子・神経メカニズムを解明することを目標とする。昨年度までに、カイコ培養細胞にCRISPR/Cas13dシステムを導入し、その有効性を実証した。そこで、今年度はCRISPR/Cas13dによるカイコ内在性遺伝子ノックダウン細胞のRNA-seq解析を行ったところ、Cas13d/gRNAの発現により標的遺伝子のmRNAを効率的かつ配列特異的に切断できるが、切断後のRNA断片が少なからず残留することが明らかになった。また、カイコ培養細胞においてCas13d/gRNAを発現させると細胞増殖の減少やhouse-keeping遺伝子の発現低下が見られることが判明した。これらの細胞では一部のトランスポゾンの発現が顕著に上昇していたことから、Cas13d/gRNAがsmall RNA経路に干渉してトランスポゾンの抑制が緩くなったと予想される。したがって、カイコではこうした点を考慮した上でCRISPR/Cas13dを使用する必要があり、今後はこれらの欠点を改善することでツールとしての利便性が上がると考えている。また、今年度はDEGの詳細な機能解析を行うため、ノックイン(TAL-PITCh法)によりDEG発現細胞特異的に外来遺伝子を発現誘導できるGAL4カイコの作出を試みた。しかし、得られたGAL4系統では全くGAL4発現を誘導できなかった。昨年度には中枢神経系特異的遺伝子(nSyb)のGAL4カイコも同様の結果であったことから、カイコにおいては5'UTR領域へのノックインでは標的遺伝子の発現パターンを模倣することが極めて難しい可能性がある。