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卵巣移行シグナルを利用した新規遺伝子改変法

利用卵巢迁移信号的新基因修饰方法

基本信息

批准号：
18J10121
负责人：
村上悠
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度は卵黄タンパク質前駆体ビテロジェニン（Vtg）の部分配列（N末300 aa：以下Vtgシグナル）により、緑色蛍光タンパク質（GFP）および発光タンパク質ルシフェラーゼ（LUC）を含む外来タンパク質を卵内へ効率的に輸送できることを見出した。一方でVtgシグナルでは最終目的とするゲノム編集ツール（Cas9）を含めた融合タンパク質（Cas9: GFP）を卵内へ送達できなかったため、Vtgの全長配列を用いることで輸送効率の向上を図った。具体的にはゲノム編集技術CRISPR/Cas9 systemを駆使し、Vtgの終止コドンの直前にCas9: GFP: polyAをノックインしたメダカを作出した。系統化を完了した後、本ノックインメダカについて蛍光観察を行うと、肝臓で明瞭な緑色蛍光が観察された。加えて、本メダカが産出した全ての卵においても明瞭かつ均一な緑色蛍光を確認できた。Vtgシグナルによって本融合タンパク質の輸送を試みた際は、卵内で緑色蛍光が見られなかったため、本結果は全長配列の利用によって狙い通り輸送効率の改善に成功したことを示す。続いて卵内でのCas9のヌクレアーゼ活性を評価するため、標的遺伝子（slc45a2; 黒色色素の合成に関連）を認識するsgRNAを受精卵内へ顕微注入した。注入卵はHeteroduplex mobility assay（HMA）解析によってslc45a2の変異の有無を確認したが、いずれのサンプルからも変異活性を示す結果は得られなかった。この原因としては、Cas9が卵内へ流入する前後で分解されたこと、あるいは卵内でのCas9の蓄積量が不足していること等が考えられる。Vtgは卵内に取り込まれた後、複数のドメインごとに限定分解されることが既知である。したがって各ドメイン間にCas9: GFP: polyAをノックインすることでこの現状の打開を図っている。

In the previous year, the yolk was partially arranged in front of the body (Vtg) (300 aa: the following Vtg eggs), and the color was partially arranged (GFP). It contains the "foreign" and "intra-egg" (LUC), which contains the percentage of eggs in the eggs. On the one hand, the most important purpose of the Vtg system is to improve the performance of the editing set (Cas9), which contains the fusion information (Cas9: GFP) that is delivered in the egg, and the full length of the Vtg column is used to improve the delivery rate. The specific editing technology CRISPR/Cas9 system makes sure that you do not need to go straight ahead to Cas9: GFP: polyA. After the systematization of the system, we should make sure that the light is observed, and the liver is aware of the color. Please add this message and make sure that you know that the color is uniform and that you are sure that the color is the same. The Vtg system is designed to improve the performance of the whole system through the use of color light in the egg, the color in the egg, and the overall performance of this result. The activity of Cas9 in the fertilized egg was detected by microinjection into the fertilized egg (slc45a2; melanin synthesis) and microinjection (sgRNA). The Heteroduplex mobility assay (HMA) analysis of the injected egg shows that the results show that the activity of the injected egg has been confirmed, and the result has been confirmed by the result of the HMA analysis. The cause of the disease, the Cas9 inflow into the egg before and after the decomposition of the egg, the accumulation of Cas9 in the egg, the insufficient accumulation of DNA in the egg, and so on. After the Vtg oocytes were extracted from the ovum, the number of copies was extracted from the ovum, and the number of copies was limited. Please open the Cas9: GFP: polyA button and open the button.