多価不飽和脂肪酸合成酵素における生産性と生産物制御機構の解明

本研究では、ドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸などの多価不飽和脂肪酸 (PUFA) の発酵生産系開発に向けた基盤研究として、多価不飽和脂肪酸合成酵素 (PUFA合成酵素) における生産性と生産物制御機構の解明に取り組んだ。前年度までの研究では生産物制御に関与する触媒ドメインβ-ketoacyl synthase/chain length factor (KS/CLF) を同定した。さらに、合成酵素を構成する各触媒ドメインと有機合成基質を用いたin vitro PUFA合成システムを再構築し、本解析系を用いてKS/CLFの機能と制御機構を明らかとした。そこで、本年度は詳細な制御機構を明らかにするため、(1)KS/CLFにおける生産物制御に関与するアミノ酸残基の同定、(2)KS/CLFの高次構造解析、(3)生産物のリリース機構の解明について検討を行った。(1)KS/CLFのマルチプルシーケンスアライメント及びPhyre2を用いたモデリングにより制御に重要なアミノ酸残基を絞り込んだ。候補残基をアミノ酸置換により変異させ、合成活性について大腸菌を用いたin vivo系で評価を行った。その結果、CLFの665番目のグルタミン酸及び、705番目のアルギニン残基の変異により生産物組成が変化したことから、これら残基が制御に重要であることがわかった。(2)KS及びCLFについて精製酵素を取得し、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて高次構造解析を行った。その結果、KSはCLFとヘテロ多量体を形成していることが示された。(3)合成酵素における生成物のリリース機構について大腸菌を用いたin vivo解析及び有機合成基質を用いたin vitro解析を行った。その結果、アシルトランスフェラーゼが生成物の加水分解反応を触媒し、生合成における最終ステップに関与することを明らかとした。

本研究では、ドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸などの多価不飽和脂肪酸 (PUFA) の発酵生産系開発に向けた基盤研究として、多価不飽和脂肪酸合成酵素 (PUFA合成酵素) における生産性と生産物制御機構の解明に取り組んだ。前年度までの研究では生産物制御に関与する触媒ドメインβ-ketoacyl synthase/chain length factor (KS/CLF) を同定した。さらに、合成酵素を構成する各触媒ドメインと有機合成基質を用いたin vitro PUFA合成システムを再構築し、本解析系を用いてKS/CLFの機能と制御機構を明らかとした。そこで、本年度は詳細な制御機構を明らかにするため、(1)KS/CLFにおける生産物制御に関与するアミノ酸残基の同定、(2)KS/CLFの高次構造解析、(3)生産物のリリース機構の解明について検討を行った。(1)KS/CLFのマルチプルシーケンスアライメント及びPhyre2を用いたモデリングにより制御に重要なアミノ酸残基を絞り込んだ。候補残基をアミノ酸置換により変異させ、合成活性について大腸菌を用いたin vivo系で評価を行った。その結果、CLFの665番目のグルタミン酸及び、705番目のアルギニン残基の変異により生産物組成が変化したことから、これら残基が制御に重要であることがわかった。(2)KS及びCLFについて精製酵素を取得し、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて高次構造解析を行った。その結果、KSはCLFとヘテロ多量体を形成していることが示された。(3)合成酵素における生成物のリリース機構について大腸菌を用いたin vivo解析及び有機合成基質を用いたin vitro解析を行った。その結果、アシルトランスフェラーゼが生成物の加水分解反応を触媒し、生合成における最終ステップに関与することを明らかとした。