多価不飽和脂肪酸合成酵素における生産性と生産物制御機構の解明

阐明多不饱和脂肪酸合成酶的生产力和产物控制机制

• 批准号: 18J10174
• 负责人: 林 祥平
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J10174/
• 关键词: 多価不飽和脂肪酸; 脂肪酸合成; 生合成; ポリケチド合成酵素

本研究では、ドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸などの多価不飽和脂肪酸 (PUFA) の発酵生産系開発に向けた基盤研究として、多価不飽和脂肪酸合成酵素 (PUFA合成酵素) における生産性と生産物制御機構の解明に取り組んだ。前年度までの研究では生産物制御に関与する触媒ドメインβ-ketoacyl synthase/chain length factor (KS/CLF) を同定した。さらに、合成酵素を構成する各触媒ドメインと有機合成基質を用いたin vitro PUFA合成システムを再構築し、本解析系を用いてKS/CLFの機能と制御機構を明らかとした。そこで、本年度は詳細な制御機構を明らかにするため、(1)KS/CLFにおける生産物制御に関与するアミノ酸残基の同定、(2)KS/CLFの高次構造解析、(3)生産物のリリース機構の解明について検討を行った。(1)KS/CLFのマルチプルシーケンスアライメント及びPhyre2を用いたモデリングにより制御に重要なアミノ酸残基を絞り込んだ。候補残基をアミノ酸置換により変異させ、合成活性について大腸菌を用いたin vivo系で評価を行った。その結果、CLFの665番目のグルタミン酸及び、705番目のアルギニン残基の変異により生産物組成が変化したことから、これら残基が制御に重要であることがわかった。(2)KS及びCLFについて精製酵素を取得し、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて高次構造解析を行った。その結果、KSはCLFとヘテロ多量体を形成していることが示された。(3)合成酵素における生成物のリリース機構について大腸菌を用いたin vivo解析及び有機合成基質を用いたin vitro解析を行った。その結果、アシルトランスフェラーゼが生成物の加水分解反応を触媒し、生合成における最終ステップに関与することを明らかとした。

This study で は, ド コ サ ヘ キ サ エ ン acid や エ イ コ サ ペ ン タ エ ン acid な ど の 価 more unsaturated fatty acids (PUFA) の 発 yeast production department open 発 に to け た base plates と し て 価 more unsaturated fatty acid synthesis and enzyme synthetic enzyme (PUFA) に お け る productive system royal institution の interpret the produce と に group take り ん だ. In the previous year, まで まで studied で で production control に related to する catalyst ドメ <s:1> <s:1> β-ketoacyl synthase/chain length factor (KS/CLF) を and determined た た. さ ら に, synthetic enzyme を す る each catalyst ド メ イ ン を と organic synthetic matrix with い た in vitro PUFA synthetic シ ス テ ム を build し again, this resolution is を い て KS/CLF の function と system royal institution を Ming ら か と し た. そ こ で, this year's detailed な は imperial institutions を Ming ら か に す る た め, (1) KS/CLF に お け る suppression the produce に masato and す る ア ミ ノ acid residues の with, (2) KS/CLF の higher order structure, (3) production の リ リ ー ス institutions の interpret に つ い て 検 line for を っ た. (1) KS/CLF の マ ル チ プ ル シ ー ケ ン ス ア ラ イ メ ン ト and び Phyre2 を with い た モ デ リ ン グ に よ り suppression に important な ア ミ ノ acid residues を ground り 込 ん だ. Alternate residues を ア ミ ノ acid replacement に よ り - different さ せ, synthetic activity に つ い て coliform を with い た in vivo is で review 価 を line っ た. そ の results, CLF の 665's mesh の グ ル タ ミ ン acid and び, 705's mesh の ア ル ギ ニ ン residues の - different に よ り production content composition が variations change し た こ と か ら, こ れ ら residues が suppression に important で あ る こ と が わ か っ た. (2) KS and び CLF に つ い て を obtain し, refining enzyme ゲ filtration ク ル ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を with い line structure analytic を っ て high times た. Youdaoplaceholder0 そ results, KS とが CLFとヘテロ manquantities を form とが て る る とが とが show された. (3) synthetic enzyme に お け る products の リ リ ー ス institutions に つ い て coliform を with い た in vivo analytical and matrix を び organic synthesis with い た line in vitro analytical を っ た. そ の results, ア シ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ が products の hydrolytic decomposition against 応 を catalyst し, biosynthesis に お け る eventually ス テ ッ プ に masato and す る こ と を Ming ら か と し た.

项目成果

多価不飽和脂肪酸生合成酵素の精密機能解析

多不饱和脂肪酸生物合成酶的精确功能分析

• 发表时间: 2019
• 作者: 林祥平;佐藤康治;丸山千登勢;濱野吉十;小笠原泰志;大利徹
• 通讯作者: 大利徹

Subtle Control of Carbon Chain Length in Polyunsaturated Fatty Acid Synthases

多不饱和脂肪酸合成酶中碳链长度的微妙控制

• DOI: 10.1021/acschembio.9b00803
• 发表时间: 2019
• 期刊: ACS Chemical Biology
• 影响因子: 4
• 作者: Naka Mai;Ikeuchi Kenshin;Hayashi Shohei;Satoh Yasuharu;Ogasawara Yasushi;Dairi Tohru
• 通讯作者: Dairi Tohru

Control Mechanism for cis Double-Bond Formation by Polyunsaturated Fatty-Acid Synthases

• DOI: 10.1002/anie.201812623
• 发表时间: 2019-02-18
• 期刊: ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION
• 影响因子: 16.6
• 作者: Hayashi, Shohei;Satoh, Yasuharu;Dairi, Tohru
• 通讯作者: Dairi, Tohru

Off-Loading Mechanism of Products in Polyunsaturated Fatty Acid Synthases

• DOI: 10.1021/acschembio.0c00075
• 发表时间: 2020-03-20
• 期刊: ACS CHEMICAL BIOLOGY
• 影响因子: 4
• 作者: Hayashi, Shohei;Ogasawara, Yasushi;Dairi, Tohru
• 通讯作者: Dairi, Tohru

精密解析に基づく多価不飽和脂肪酸生合成酵素の機能改変

基于精确分析的多不饱和脂肪酸生物合成酶的功能修饰

• 发表时间: 2019
• 作者: 林祥平;佐藤康治;小笠原泰志;大利徹
• 通讯作者: 大利徹