CAR-T細胞機能を向上させるCAR構造の最適化

优化CAR结构，提高CAR-T细胞功能

• 批准号: 22K07298
• 负责人: 西尾 信博
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07298/
• 关键词: CAR; GD2; piggyBac

本研究では、CARの構成成分のうち、scFv部分の中のVHとVLをつなぐlinker部分の長さとspacer部分の長さに着目して、CARを改変し、その機能解析を実施する。ベースとなるCARはGD2を標的としたGD2.CARを用い、遺伝子導入には代表者らが開発したpiggyBacトランスポゾン法を用いる。linkerとspacerを改変した複数のCARコンストラクトを作成し、細胞殺傷効果と持続性において最適なGD2.CARを作製し、神経芽腫細胞に対するGD2.CAR-T細胞の抗腫瘍効果を評価する。異なる抗原認識部位の配列情報とCD28、4-1BBなどの異なる共刺激分子をもつGD2.CARに、さらにlinkerとspacerを改変した複数のGD2.CARコンストラクトを作成した。上記のGD2.CARを、申請者が所有するCD19.CARトランスポゾンベクター（pIRII-CD19.28.ζ）のCAR配列と入れ替え（pIRII-GD2.28.ζまたはpIRII-GD2.4-1BB.ζ）、GD2.CARトランスポゾンベクターを作成した。末梢血リンパ球に、ヌクレオフェクション装置を用いて、GD2.CARトランスポゾンベクターとpiggyBac遺伝子転位酵素ベクターを導入し、自家feeder細胞とインターロイキン(IL)-7およびIL-15を添加した培地中で共培養し、GD2CAR-T細胞を作成した。フローサイトメトリーを用いてT細胞上のGD2.CAR発現率、CD45RA/CCR7細胞比率等を測定した。さらにCAR-T細胞と神経芽腫細胞株をサイトカイン無添加・10%血清存在下で共培養し、GD2.CAR-T細胞の抗原特異性、細胞傷害活性、細胞表面exhaustionマーカー、CAR-T細胞のpersistencyなどを検討した。

In this study, the components of CAR, VH and VL in scFv, length of linker, length of spacer, modification of CAR, and functional analysis were carried out. GD2. CAR is used in conjunction with the piggyback method. Linker and Spacer Changes: Multiple CAR Cell Types, Cell Killing Effects, and Persistence: Optimal GD2. CAR Control: Neuroblast-related GD2. Evaluation of CAR-T Cell Anti-tumor Effects. Costimulatory molecules such as CD28, 4-1BB, and CD28 can be used to identify different antigen recognition sites. The above GD2.CAR file and applicant file are all CD19.CAR file types (pIRII-CD19.28. zeta), CAR file types (pIRII-GD2.28. zeta), GD2.CAR file types (pIRII-GD2.4-1BB. zeta), and GD2.CAR file types (pIRII-CD19. 28. zeta). In the process of using peripheral blood cells, GD2.CAR cells, GD2.CAR cells, GD2 GD2. CAR detection rate and CD45RA/CCR7 cell ratio on T cells were measured. CAR-T cells and neuroblastoma cell lines were co-cultured in the presence of 10% serum without additives. GD2.CAR-T cell antigen specificity, cell injury activity, cell surface exhaustion, and CAR-T cell persistence were investigated.