Analysis of new regulatory mechanism of protein deamidation and it's functional using oral cancer cells

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タンパク質の機能は、立体構造の変化によって調節される。特定アミノ酸残基のリン酸化やアセチル化、アミド化などの翻訳後修飾は、重要なタンパク質の機能調節系である。タンパク質のアミド基を取り除く脱アミド化反応は、長い間、徐々に進行する酵素に依存しない「 化」と考えられてきた。しかし、ある種の免 疫系タンパク質の短時間に起こる脱アミド化が、がん細胞や微生物による免疫回避に重要な役割を果たす、という新たなモデルが提唱された。近年、転写因子NF-κBのメインサブユニットであるp65の64番目および139番目のアスパラギン（N）が脱アミド化（アスパラギン酸へ変異：D）することが報告されたが、その機能は不明な点が多い。まず、p65の脱アミド化部位（N64D, N139D）を含むペプチドを抗原として、脱アミド化p65 を特異的に認識する抗体を作製した。N64Dに対する抗体は特異性が著しく低く作製できなかったが、N139Dに対する抗体を得ることができた。しかし、N139Dだけでなく野生型p65も認識してしまうので、現在抗体の希釈濃度を検討中である。FLAG TagおよびGFPを融合したp65変異体（N64D, N139D, および2つの変異を持つDD）を作製して転写活性を調べた。N64Dは野生型と殆ど変化しなかったが、N139Dは転写活性が40%まで低下した。DDは転写活性が25%まで低下したが、DD変異体の発現そのものが著しく低下しており、DDの転写活性の低下は発現量の低下に起因すると考えられた。現在、２種類のマウスがん細胞（SCCVII細胞、およびB16細胞）の内在性のp65をゲノム編集でノックアウトし、野生型およびp65変異体を恒常的に発現する細胞株を樹立中である。