Inverse genetics: A new methodology for the identification of key genes of somatic cell differentiation

反向遗传学：鉴定体细胞分化关键基因的新方法

• 批准号: 21K19603
• 负责人: 久保田 聡
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-07-09 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19603/
• 关键词: reprogramming; iPS cell; chondrocyte; transcription factor; lncRNA; master gene; differentiation

本年度に行う研究の第一の目的は、本研究で提唱する「インバース・ジェネティクス方法論」を、軟骨細胞を用いて検証することであった。この方法論は、細胞がiPS細胞にリプログラミングする過程を解析し、時間を遡る形で細胞の分化過程を明らかにしようという試みである。初年度の研究ではまず、ヒト正常軟骨細胞が山中4因子 (OSKM) によってiPS細胞様のコロニーを形成することを、おそらく世界で初めて確認できた。さらに軟骨細胞にOSKMに加えて、軟骨細胞分化のマスター遺伝子であるSOX9を発現させることでリプログラミングを阻害することにも成功した。つまり「リプログラミング過程は分化の逆行である」という仮説の裏付けは得られていた。しかしこのリプログラミングに向かう細胞を1細胞解析で追うために必要なOSKM導入効率と、フィーダー細胞の除去方法などを初年度は得るに至らなかった。しかし本年度はOSKMに加えてさらに２因子 (OSKM+2) を同時発現する一体型山中因子発現ウイルスベクターの導入によって前者の問題を、そしてフィーダー細胞不要の培養システムの確立により後者の問題を一挙に解決することができた。これら新実験システムの下、ヒト正常軟骨を効率よくiPS細胞に導き、その過程で細胞のトランスクリプトームが刻々と変化する状況を毎日、10日間に渡ってゲノムワイドでモニターすることに成功した。その結果、OSKM+2強制発現のわずか２日で軟骨細胞のトランスクリプトームはiPS細胞に向けて大きな変化を見せ、３日目にはiPS細胞にきわめて近くなり、その後一週間をかけてiPS細胞に到達することが明らかになった。最も重要なことは、２日目にSOX9の発現が急激に低下したことで、これによってインバース・ジェネティクスを支える仮説「リプログラミングは細胞分化の道筋の逆行である」ことの直接的証拠が得られたことになる。

Line this year に う research の first は の purpose, this study で す sing る "イ ン バ ー ス · ジ ェ ネ テ ィ ク ス methodology" を を, cartilage cells with い て 検 card す る こ と で あ っ た. こ の methodology は, が iPS cells に リ プ ロ グ ラ ミ ン グ す る process analytical し を, roving time を る の で cell differentiation process を Ming ら か に し よ う と い う try み で あ る. Early annual の research で は ま ず, ヒ ト normal cartilage cells が mountain four factors (OSKM) に よ っ て iPS cells others の コ ロ ニ ー を form す る こ と を, お そ ら く め the early で て confirm で き た. さ ら に chondrocytes に OSKM に plus え て, cartilage cell differentiation の マ ス タ ー posthumous son 伝 で あ る SOX9 を 発 now さ せ る こ と で リ プ ロ グ ラ ミ ン グ を resistance against す る こ と に も successful し た. つ ま り "リ プ ロ グ ラ ミ ン グ の retrograde process は differentiation で あ る" と い う 仮 said that the の け は must ら れ て い た. し か し こ の リ プ ロ グ ラ ミ ン グ に to か う cells を 1 parsing で chase う た め に necessary な OSKM import と working rate, フ ィ ー ダ の ー cells remove method な ど を annual は too early る に to ら な か っ た. し か し this year は OSKM に plus え て さ ら に factor 2 (OSKM + 2) を 発 now at the same time す る a shape factor in mountain 発 now ウ イ ル ス ベ ク タ ー の import に よ っ て の を, the former そ し て フ ィ ー ダ ー cells don't の cultivate シ ス テ ム の establish に よ り latter の problem を 挙 に solve す る こ と が で き た. こ れ ら new be 験 シ ス テ ム の, ヒ ト normal cartilage を sharper rate よ く iPS cells に き, そ の process で cells の ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム が carved 々 と variations change す る condition を in their day, 10 day に crossing っ て ゲ ノ ム ワ イ ド で モ ニ タ ー す る こ と に successful し た. そ の results, compulsory 発 OSKM + 2 is の わ ず か 2 で chondrocytes の ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム は に iPS cells to け て big き な - see を せ, 3 eyes に は iPS cells に き わ め て nearly く な り, そ の after a week between を か け て iPS cells reach に す る こ と が Ming ら か に な っ た. Most important な も こ と は, 2 eyes に SOX9 の 発 が nasty shock now low に し た こ と で, こ れ に よ っ て イ ン バ ー ス · ジ ェ ネ テ ィ ク ス を branch え る 仮 said "リ プ ロ グ ラ ミ ン グ は cell differentiation の way reinforced の retrograde で あ る" こ と の direct evidence 拠 が have ら れ た こ と に な る.

项目成果

軟骨細胞でのRFX1によるCCNファミリータンパク質3遺伝子制御メカニズム。

软骨细胞中 RFX1 调控 CCN 家族蛋白 3 基因的机制。

• 发表时间: 2021
• 作者: 水川朋美;西田 崇;明石 翔;河田かずみ;菊池 菫;川木晴美;滝川正春;上岡 寛;久保田聡
• 通讯作者: 久保田聡

軟骨細胞におけるRFX1を介したCCN3の発現制御機構の解明

阐明软骨细胞中RFX1介导的CCN3表达调控机制

• 发表时间: 2021
• 作者: 水川朋美;西田 崇;明石 翔;河田かずみ;菊池 菫;川木晴美;滝川正春;上岡 寛;久保田聡
• 通讯作者: 久保田聡

RFX1‐mediated CCN3 induction that may support chondrocyte survival under starved conditions

• DOI: 10.1002/jcp.30348
• 发表时间: 2021-03
• 期刊: Journal of Cellular Physiology
• 影响因子: 5.6
• 作者: Mizukawa Tomomi;Takashi Nishida;Sho Akashi;Kazumi Kawata;Sumire Kikuchi;Harumi Kawaki;M. Takigawa;H. Kamioka;S. Kubota

軟骨組織の加齢変性におけるCCN3の機能。

CCN3 在与年龄相关的软骨组织退化中的功能。

• 发表时间: 2022
• 作者: 桑原実穂;近藤 星;Fu Shanqi;大野充昭;古松毅之;中田英二;滝川正春;服部高子;久保田聡
• 通讯作者: 久保田聡

Quiescence is golden: cellular communication network factor 3 as "Yin" versus "Yang" in cartilage

静止是金：细胞通讯网络因子 3 作为软骨中的“阴”与“阳”

• 发表时间: 2022
• 作者: Kubota;S.
• 通讯作者: S.